微生物限度检验操作作业规程.docVIP

20XX版微生物程度检验操作规程 目标 建立微生物程度检验操作规程，规范操作，确保结果正确性。 范围 成品、辅料、内包装袋及纯化水检验。 内容概述：本检验操作规程依据中国药典20XX年版四部《通则1105 非无菌产品微生物程度检验：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物程度检验：控制菌检验法》进行检验。 微生物计数法 一、计数方法 1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长嗜温细菌和真菌计数。 2、计数方法 本法包含平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检验和供试品计数方法适用性检验 供试品微生物计数中所使用培养基应进行适用性检验。供试品微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采取方法适合于该产品微生物计数。 4、菌种及菌液制备 4.1试验用菌株传代次数不得超出5代（从菌种保藏中心取得干燥菌种为第0袋），并采取适宜菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检验和计数方法适用性试验见表1。 4.2菌液制备 按表1要求培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液；取黑曲霉新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采取适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保留在2-8℃，可在二十四小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保留在2-8℃，在验证过贮存期内使用。 表1 试验菌液制备和使用 4.3阴性对照 为确定试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 4.4培养基适用性检验 根据表1要求，接种小于100cfu菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置要求条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时用对应对照培养基替换被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上菌落平均数和对照培养基上菌落平均数比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应和对照培养基上菌落一致。被检液体培养基管和对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性检验 5.1供试品制备 依据供试品理化特征和生物学特征，采取适宜方法制备供试液。制备时若需加温应加热均匀且温度不得超出45℃。供试液从制备到加入检验用培养基不得超出1小时。 5.1.1成品、辅料供试液制备 取供试品，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基或稀释制成1:10供试液，若需要，调整供试液PH至6-8，必需时用同一稀释液将供试液深入10倍稀释系列。水溶性液体制剂也可用混合供试品原液作为供试液。 5.1.2内包装膜、袋：取供试品100cm2，剪碎，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1:10供试液。若需要，调整供试液PH至6-8，必需时用同一稀释液将供试液深入10倍稀释系列。 5.2接种和稀释 按下列要求进行供试液接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液体积应不超出供试液体积1%。为确定供试品中微生物能被充足检出，应首先选择最低稀释级供试液进行计数方法适用性试验。 5.2.1试验组 取上述制备好供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液所含菌量小于100cfu。 5.2.2供试品对照组 取制备好供试液，以稀释液替换菌液同试验组操作。 5.2.3菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂对应稀释液替换供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。 5.3供试品中微生物回收 表1所列计数方法适用性试验各试验菌应逐一进行微生物回收，微生物回收采取平皿法。 5.3.1平皿法 采取倾注法，表1中每株试验菌每种培养基最少制备2个平皿。取照上述“供试液制备”和“接种和稀释”制备供试液1ml，置直径90mm无菌平皿中，注入15-20ml温度不超出45℃熔化胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌液，计算各试验组平均菌落数。 5.3.2薄膜过滤法 采取滤膜孔径小于0.45um。滤膜直径通常为50mm。滤器及滤膜使用前应采取适宜方法灭菌。使用时，应确保滤膜在过滤前后完整性。水溶性供试液过滤前先将少许冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次