古典猪瘟检疫规程.doc

古典猪瘟检疫规程 1　范围 本标准规定了古典猪瘟临床诊断、实验室检测的技术规范。 本标准适用于古典猪瘟病毒和抗体的检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GＢ/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ＢD：边界病 ＢVD：牛病毒性腹泻 CSF：古典猪瘟 CSFV：古典猪瘟病毒 FAT：荧光抗体试验 FAVN：荧光抗体病毒中和试验 FITC：异硫氰酸荧光素 HRPO：辣根过氧化物酶 IFA：免疫荧光实验 NPLA：过氧化物酶联中和试验 4　临床诊断 4.1　流行病学 CSFV在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，-年四季均可发生。病猪、潜伏期和康复期带毒猪均能把病毒传播给易感猪。病猪是主要传染源，病猪排泄物和分泌物，病死猪及其脏器，急宰病猪的血、肉和内脏，废水、废料污染的饲料和饮水都可散播病毒。猪瘟主要通过接触传播，经消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、木乃伊胎等。急性病例在1周～2周内死亡，亚急性和慢性病例，病程可长达2周～4周，甚至数月。 4.2　临床症状 CSFV在所有年龄猪中传播，典型症状为发热、倦怠、结膜炎、厌食、呕吐、腹泻、呆滞和步履蹒跚等。 出现临床症状后数天，在眼、腹和大腿内侧会出现紫色斑点。非典型症状则没有体温升高现象，但猪呈渐进性消瘦。 4.3　病理变化 急性病例病理变化不明显或缺乏。典型病例淋巴结呈大理石样红色变化，心外膜、肾、膀胱浆膜、皮下和真皮下出血；亚急性和慢性病例，除有以上病变外，还会在胃肠道粘膜、会咽和喉粘膜中出现坏死性或“纽扣”状溃疡。 根据流行病学、临床症状和病理变化可作出CSF的初步诊断，但确诊应经实验室试验。 5　实验室诊断 5.1　荧光抗体试验 5.1.1　 5.1.1.1　荧光显微镜。 5.1.1.2　冷冻切片机。 5.1.1.3　CSFV荧光抗体结合物。 5.1.1.4　PBS（见A.1），实验用水应符合GＢ/T6682规定。 5.1.1.5　碳酸盐甘油缓冲液（见A.2）。 5.1.1.6　丙酮（分析纯）。 5.1.1.7　载玻片、盖玻片。 5.1.2　 5.1.2.1　取样 取病猪的扁桃体、脾、肾等病料置冰箱内待检。每-试验都应设阳性和阴性组织样品切片作为对照。 5.1.2.2　样品处理 在实验室内将样品组织块修剪出约1Cm×1Cm×0.5Cm的小块，不经任何固定处理，用冷冻包埋剂包埋或加上蒸馏水置于冰盒中，让组织块在冰盒中冷冻。 5.1.2.3　切片 将组织块切成4μm以下切片，置于10mm×32mm-角切除的洁净盖玻片上。所有切片以相同的方式放置（如缺口朝右向上）。 5.1.2.4　固定 置丙酮中室温固定10min或37℃空气干燥20min。 5.1.2.5　浸润 将切片在PBS中浸润片刻，用吸水纸吸去多余的水分，放在湿盒中的架子上。 5.1.2.6　加猪瘟荧光抗体结合物 滴加工作浓度的猪瘟荧光抗体结合物到切片上，在密闭的湿盒中37℃作用30min。若需要加第二FITC结合物，置室温下2min，用PBS洗5次。然后滴加工作浓度的FITC结合物，在密闭的湿盒中 37℃作用30min。室温下再用PBS洗5次，每次 5.1.2.7　封片 自然干燥后，用碳酸盐甘油缓冲液封片。荧光显微镜观察结果。 5.1.2.8　结果判定 CSF阳性切片细胞胞浆内呈现亮绿或黄绿色荧光。在扁桃体隐窝上皮细胞、肾脏皮质远端及近端小管和髓质集尿管细胞、回肠腺体上皮细胞、脾脏动脉周围淋巴样鞘的类淋巴细胞等细胞的细胞浆内呈现亮绿色荧光的样品，可判为阳性；细胞浆内无亮绿色荧光的样品为阴性；细胞浆内呈现弱的黄绿色荧光的样品为可疑；可疑结果经过重复试验，细胞浆内仍呈现弱的黄绿色荧光可判为阳性。 5.2　单克隆抗体免疫过氧化物酶试验 5.2.1　 5.2.1.1　显微镜。 5.2.1.2　冷冻切片机。 5.2.1.3　HRPO结合CSF毒株、CSF疫苗株、BVD/BD毒株的3种特异性单克隆抗体。 5.2.1.4　HRPO结合的抗CSFV免疫球蛋白多克隆抗体。 5.2.1.5　染色底物（配制见A3）。 5.2.1.6　5％马血清。 5.2.1.7　丙酮（分析纯）、醋酸钠、吐温-80。 5.2.1.8　PBS（见A.1）。 5.2.2　 5.2.2.1　取样 取8个或更多切成4μm的FAT阳性扁桃体冰冻切片，如果取不到扁桃体也可用其他阳性器官。 5.2.2.2　固定 在丙酮中将切片用飞片法固定10min，空气中干燥。 5.2.2.3　HRPO-抗体结合物工作液的制备 分别制