生物合成关键技术.doc

生物合成技术 生物技术，又称生物工程或生物工程技术，是生物科学和工程技术相结合而形成新学科。生物技术关键包含基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。基因工程又称为重组DNA技术，是经过人工操作，在分子水平上进行基因重组、改造和转移，以取得含有新遗传特征细胞，合成大家所需物质技术过程。酶工程是酶生产和应用技术过程。即是经过人工操作，取得大家所需酶，并经过多种方法使酶发挥其催化功效技术过程。细胞工程是在细胞水平上改变细胞遗传特征或经过大规模细胞培养以取得大家所需物质技术过程。发酵工程又称为微生物工程，是在人工控制条件下，经过微生物生命活动而取得大家所需物质技术过程。发酵方法关键分为固体发酵和液体发酵两大类。生物技术能够定向改造生物、加工生物材料，有目标地利用生命过程，广泛应用于医药、农林牧渔、生态、轻工食品、化工、能源、材料、海洋开发及环境保护等领域，包含面广，促进传统产业改造和新型产业形成。 试验1 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 一、试验目标 1. 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞方法。 2. 学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体方法。 二、试验原理 转化是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞取得新遗传性状一个手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域基础试验技术之一。 转化过程所用受体细胞通常是限制-修饰系统缺点变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶突变株。受体细胞经过部分特殊方法处理后，细胞膜通透性发生改变，成为能许可外源DNA分子经过感受态细胞。在一定条件下，将外源DNA分子和感受态细胞混合保温，使外源DNA分子进入受体细胞。进入细胞DNA分子经过复制、表示实现遗传信息转移，使受体细胞出现新遗传性状。将经过转化后细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体。 本试验以E. coli DH 5α菌株为受体细胞，用氯化钙处理受体菌使其处于感受态，然后在一定条件下和pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，所以使接收了该质粒受体菌也含有抗氨苄青霉素和抗四环素特征，常见Ampr，Tetr符号表示。将经过转化后全部受体细胞经过合适稀释后，在含有氨苄青霉素抗四环素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化受体细胞则因无抵御氨苄青霉素和四环素能力全部被杀死，全部带有抗药基因质粒DNA能使受体菌从对抗菌素敏感（Amps，Tets）转变为含有抗药性（Ampr，Tetr），即表明了该质粒含有生物活性。这种转化活性是检验质粒DNA生物活性关键指标。 转化体经过深入纯化扩增后，再将转入质粒DNA分离提取出来，可进行反复转化、电泳、电镜观察及做限制性内切酶酶解图谱、分子杂交、DNA测序等试验判定。 为提升转化率，试验中要注意以下多个关键原因： （1）细胞生长状态和密度：不要用已经过数次转接及贮存在4℃或室温培养菌液；细胞生长密度以每毫升培养液中细胞数在5×107个左右为最好（可经过测定培养液A600nm控制），密度不足或过高均会使转化率下降。 （2）转化质粒DNA质量和浓度：用于转化质粒DNA应关键是共价闭环DNA（即cccDNA，又称超螺旋DNA），转化率和外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA量过多或体积过大时则会使转化率下降。 （3）试剂质量：所用试剂，如氯化钙等，应是高质量，且最好分装保留于干燥暗处。 （4）预防杂菌和其它外源DNA污染：全部器皿，如离心管、分装用Eppendorf管等，一定要洁净，最好是新。整个试验过程中要注意无菌操作。 氯化钙转化法由Cohen等首创。其转化率通常能达成每1 μg超螺质粒DNA产生5×106~2×107个转化体，足以满足常规基因克隆试验需要。该法含有简单、快速、稳定、反复性好、菌株适用范围广等优点而被广泛采取。 三、仪器、材料和试剂 材料：E. coli DH 5α 受体菌（Amps，Tets），pBR322质粒 试剂：含抗菌素LB平板培养基：将配好LB固体培养基高温灭菌20 min后，冷却至60℃左右，加入氨苄青霉素和四环素贮存液，使终浓度分别为50 μg/mL和12.5 μg/mL，摇匀后铺板。 LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，氯化钠 10 g/L，用氢氧化钠调整至pH 7.5。120℃高温灭菌20 min。 氨苄青霉素和四环素贮存液：用50%乙醇配制。 0.1 mol/L 氯化钙溶液：每100 mL溶液中含无水氯化钙1.10 g，用无菌重蒸水配制，灭菌处理。 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱、分光光度计、台式离心机、带盖离心管、吸量管或自动加样器、Eppendorf管等。 四、试验内容 1. 感受态细胞制备 （1）从新活化E. coli DH 5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3