脂肪酶的概述及应用.docx

. 脂肪酶的概述与应用 一 脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如、，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和；动物体内含脂肪酶较多的是的胰脏和，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的中含有少量的酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化酯及其他一些水不溶性酯类的、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于合成精细化学品和有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于的酯键，使甘油三酯降解为、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或等许多因素的影响。 脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是和细菌。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。 脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、、甘油单酯及。水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液，以滴定值表示。 二 脂肪酶的结构解析 分子结构 研究表明, 来源不同的脂肪酶 ,其氨基酸组成数目从 270 ～ 641 不等 , 其分子量为29 000～ 100 000。迄今为止 ,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达 , 并利用 X-衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构 、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组(triad)结构 。表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。正如下表所示, 多数酶都有变种(如 CCL(A)和CCL(B)、GCL Ⅰ和 GCL Ⅱ等),不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列, 其氨基酸组成数目完全相同, 不同的只是个别氨基酸的差异 。一般而言, 不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同 , 而且位置不变;其分子量和等电点略有不同。 脂肪酶催化中心三元组 研究表明，尽管不同来源的脂肪酶有不同的氨基酸组成(残基数目、分子量 、三维空间结构等),但由于生物的同源性和进化过程的保守性 ,其催化中心拥有相似或相同的特征区 His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W 、X、Y、Z 指非特异性氨基酸)。如图1所示，绝大多数脂肪酶的活性中心都由 Ser 和 His 参与组成, His、Ser与另一种氨基酸残基(如 CCL 和 GCL的Glu、RML 和 hPL 的 Asp 等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组(triad)。如图 2 所示 立体结构 具体参数方法： 三．脂肪酶的纯化与表达 pPIC9k- mRCL 表达质粒的构建 1.以华根霉基因组DNA为模板使用PCR方法扩增RCL（华根霉脂肪酶全基因）成熟肽，扩增的基因片段纯化后克隆到载体 pMD19-T Vector 中，转化E.coli.DH5α及进行重组质粒的筛选，由此构建重组质粒 pMD19-mRCL 。 2.由质粒 pMD19-mRCL切下目的基因片