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分子考试资料整理 粒 DNA的构型与 泳速率的关系 答： DNA分子的迁移速率取决于由 DNA分子的大小与构型而形成的分子 效 。 ①在相同的构型下， DNA分子迁移速率与其相 分子量成反比。 ②相同分子量但不同构型的 DNA分子迁移速率不同。当 脂糖凝胶的 度 低 ， 泳速率 ：超螺旋 DNA 性 DNA＞开 DNA。 碱裂解法提取 粒 DNA的原理以及三种溶液的作用①基本原理 粒的分离是利用 粒 DNA与染色体 DNA在 性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在 NaOH和 SDS溶液中裂解 ，蛋白 与 DNA 生 性，由于染色体 DNA 与 粒 DNA拓朴构型不同 , 染色体 DNA双螺旋 构解开， 而共价 粒 DNA的 被 断裂，但两条互 彼此相互 仍会 密地 合在一起。当加入中和液后 , 溶液 pH 恢复至中性，在高 度的情况下，染色体 DNA之 交 形成不溶性网状 构并与蛋白 -SDS复合物等形成沉淀；不同的是， 粒 DNA复性迅速而准确，保持可溶状 而留在上清中。 ，通 离心可沉淀大部分 胞碎片、染色体 DNA、RNA及蛋白 。除去沉淀后上清中的 粒可用酚 仿抽提 一步 化 粒 DNA。 ②三种溶液的作用（ 溶液 I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA 液 II ， N NaOH / 1% SDS ( 新 的 ) ；溶液 III ，3 M 醋酸 / 2 M 醋酸。）  ，pH  ；溶 溶液  I:  Tris-Cl:  适当  pH , 葡萄糖：增加溶液的粘度， 持渗透 ，防止 的大 杆菌不会快速沉 到管子的底部 ,  DNA受机械剪切力作用而降解  ,  浮后 EDTA:抑制 DNase的活性，和抑制微生物生 ( 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合 ) 溶液 II ：NaOH：是最佳的溶解 胞的 。 一步要 住两点：第一，不能用旧的 NaOH；第二， 不能 ， 必 温柔混合，不然基因 DNA也会断裂。 SDS: 是离子型表面活性 。它主要功能有：（ 1）溶解 胞膜上的脂 与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏 胞膜。（ 2）解聚 胞中的核蛋白。（ 3） SDS 能与蛋白 合成 R-O-SO3-?R＋ - 蛋白 的复合物，使蛋白 性而沉淀下来。 溶液 III ：醋酸 : K+ 离子会与 SDS形成溶解度很低的 并与蛋白 形成沉淀而除去； 高浓度的盐，使得沉淀更完全（在 pH为 8 左右的溶液中， DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或 KAC，使 Na+中和 DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA钠盐沉淀）。 2 M 的醋酸 : 中和 NaOH，创造质粒复性的环境。 感受态细胞制备过程应注意的问题；①细胞的生长状态和密度 最好从 -70 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5×107 个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 OD600（）控制。 （应注意 OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制 - 修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ②质粒 DNA的质量和浓度 一般地，  DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的  5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分 子量大的转化效率低；  重组  DNA分子的构型与转化效率也密切相关，  环状重组质粒的转化率较分子量 相同的线性重组质粒高  10-100  倍。 ③整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿及试剂都要灭菌。 ④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、 DNA酶或杂 DNA所污染 ⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 ⑥ CaCl2 处理后细胞很脆，动作要轻，慢。 ⑦化合物及无机离子的影响： 在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）； 挖胶过程应注意什么①保证切下的条带没有外源 DNA的污染。②切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。③切胶时尽量在 长波长下进行，减少紫外对 DNA的损伤。④为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。 如何灭活 RNase A. RNase 灭活剂 ① 焦磷酸二乙酯（ DEPC）：是一种强烈但不彻底的 RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 ② 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的