(完整word版)膜蛋白提取.doc

1  分离组织膜蛋白的方法  ： 1、取组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、 J6-HC 离心机 800rpm ， 4 ℃离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g ， 4℃离心 1hr 。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B 重悬，冰上孵育  2hr  后分装 EP 管， Eppendorf 台式离心机 10000rpm ， 4 ℃离心 30min 。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A ： 0.32M 蔗糖， 5mM Tris-HCl （PH 7.5 ），120mM KCl 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin  ，1mM EDTA,1mM EDTA, 。冰上预冷。 Buffer B ：20mM HEPES （ PH 7.5 ），10% 甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。 冰上预冷。 2 取约 0.1g 肝组织，加入 2ml 粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次 20 秒，间隔 30 秒，共 次， 4° c 10 5xg 条件下离心 2 小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入 1ml 胞膜蛋白提取  3 液，超声粉碎， 4 ° c 10 5 xg 条件下离心 2 小时，上清液为 胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采 用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1． 将细胞种于 T75 或 T175 的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将 PBS/EDTA 溶液 (NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%) 加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化 3～ 5 分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。 2． 收集细胞悬液于 10 毫升或 50 毫升的离心管中， 1000rpm 离心 10 分钟，去上清液。 3 ． 按 2.5 毫 升 （ T75 ） / 每 瓶 或 5 毫 升 （ T175/ 每 瓶 加 入 冰 冷 的 匀 浆 液 HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM ）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4． 将匀浆液转入离心管中， 加入适量的 Tris – HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10 分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的 tris-HCl buffer. 4 度 18000rpm(40000g) 离心，共离心三次。 5． 在最后一次离心得到沉淀中按 250 微升每瓶（T75 ）或 500 微升每瓶（ T175 ）加入 tris-HCl buffer ，匀浆，取 50 微升匀浆液测量蛋白浓度。 6． 按实验要求，将匀浆分装于 1 毫升的 Eppendoff 管中，其于 -80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在  40000g 时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光， 可以用荧光抗体染色， 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察， 具体的 protocol 可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在 膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内， 则需要用无水甲醇在 -20 度处理 10min ，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞 内与蛋白结合。 4 一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法分离， 可是我们现有的离心机都 无法达到所需要的转速，所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的办法。 1） 预冷的 pbs 洗去组织血液，除去结缔组织、脂肪。 2） 4 ℃剪碎，加 bufferA 玻璃匀浆器匀浆至无大块状物， 10 ℃超声波 10min ，重悬，再破 碎 5— 10min 。 3） 12000rpm 离心 10min ，沉淀用 bufferB 重悬， 20 ℃超声波 10min 。 4） 12000rpm 离心 10min ，沉淀用 bufferC 抽提。 5） 12000rpm 离心 10min ，所得上清含有 9%的膜蛋白。 6） 12000rpm 离心 10min ，沉淀加 bufferD 沸水煮 5min ， 12000rpm 离心 10min ，上清含有 1%的膜蛋白。 bufferA: 40mM Tris base buffer