琼脂糖凝胶电泳操作统一标准作业流程.docxVIP

琼脂糖凝胶电泳操作标准步骤 试验目标: 琼脂糖凝胶电泳是常见检测核酸方法，含有操作方便、经济快速等优点。DNA琼脂糖凝胶电泳使用技术仅代表含有操作琼脂糖电泳能力。 试验原理: 琼脂糖凝胶电泳是常见用于分离、判定DNA、RNA分子混合物方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时电荷效应和分子筛效应，达成分离混合物目标。DNA分子在高于其等电点溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身大小和构型是关键影响原因。DNA分子迁移速度和其相对分子量成反比。不一样构型DNA分子迁移速度不一样。如环形DNA分子样品，其中有三种构型分子：共价闭合环状超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不一样构型分子进行电泳时迁移速度大小次序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。 影响核酸分子泳动率原因关键还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度；3、DNA构想；4、所用电压；5、琼脂糖种类；6、电泳缓冲液。 核酸电泳中常见染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一个扁平分子，能够嵌入核酸双链配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不一样效应。254nm紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，即使灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品观察和回收等操作。300nm紫外线照射灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。 材料、试剂及器具 材料：不一样大小基因组片段 试剂：Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D20XX(TianGen)；琼脂糖；加样缓冲液（6x）：溴酚蓝；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 仪器及器具：（1）移液器、吸头、锥形瓶（2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。（3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 操作步骤 器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要器具清洗洁净，包含托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗步骤为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最终用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 配胶：依据基因组片段大小，配置对应浓度琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗洁净并加入少许纯水煮沸，然后量取一定量电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取对应量琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，最终放入微波炉煮，煮胶过程中需注意安全，应合适摇匀，预防爆沸。煮好凝胶需无气泡、色泽均匀。将煮好凝胶放入65℃水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，立即将凝胶倒入装好洁净模具中。待凝胶完全凝固后，将凝胶小心转移至4℃冰箱，冷冻30min，然后拔梳子。此时，凝胶需平整、不漏孔，能够用于电泳检测。 电泳准备：先将洁净电泳槽排放整齐并做好标识，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔方向朝向负极（注意：①放凝胶前，需将胶托底部凝胶抹洁净，预防胶托在电泳槽中滑动；②此时，可顺便观察凝胶是否漏孔），再往电泳槽中倒入一定量电泳缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没。（注意保持桌面卫生，预防缓冲液洒到桌面） 上样：将样品、6×溴酚蓝按3：1百分比混匀，轻甩后根据要求次序上样，上样次序应和电泳槽上标识一致，最终点上一定量Ladder。（注意：①上样时必需确保上样次序正确无误，样品间不混淆，点样后空管子先放在电泳槽旁边，用于核查；②点样时不戳孔、不外漏、不溢出；③点样时需小心枪头不要碰到凝胶，以免凝胶挪动，若凝胶已经挪动，需等样品完全沉到底部后，再固定凝胶） 电泳：确定已经正确上样后，双手盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽（注意：确定电极正确连接），设置电泳参数：电压：120V，电流：300mA，时间：30min（溴酚蓝跑至胶2/3为宜）；注意确定电极、电泳参数完全正确以后，最终按star键开始电泳。 染胶：电泳结束以后，带上PE手套，小心滑出凝胶，把凝胶转移到洁净PE手套上（注意：PE手套上应做好标识，确保样品、电泳槽、PE手套标识是一致），小心地将凝胶放入对应标识EB染胶盘中，盖上盖子染30min。其中，染胶盘放在EB暗房中，EB染液配方为：100ml 1×TAE+5ul EB染料。（注意：①配制EB染液和染胶时需戴上乳胶手套、PE手套，必需时可戴上口罩，染胶时动作要轻，预防溅起EB染液；②注意区分EB污染区和非污染区，预防EB污染区向非污染区扩散） 凝胶成像：带上PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时那个PE手套上（注意：捞胶时需小心预防凝胶断裂、滑落，尽可能把多出EB染液甩干），将凝胶放入凝胶成像系统中，根据“Tanon凝胶成像