博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标.docxVIP

博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标 【摘要】目的:观察博莱霉素诱导的肺纤维化模型中组织羟脯氨酸 （Hyp） 及各氧化应激指标的变化，探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的作用.方法: 二级SD大鼠40只，随机分为模型组与对照组，每组20只.气管内注入博莱霉素 A5（BLMA5辫液，建立肺纤维化模型.分别于3,7,14和28 d每组随机抽出5只, 处死后取肺脏行HE, Masson染色鉴定模型并测定Hyp含量.同时分别以八木国 夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物（MDA）;改良盐酸羟胺法测定组织总超氧化 物歧化酶（SOD）的酶活力；改良荧光法测定还原型谷胱甘肽（GSH梏量;荧光法测 定氧化型谷胱甘肽（GSSG含量.并计算GSH/GSSGL结果：成功建立博莱霉素 诱导的肺纤维化模型.各指标在不同时间点出现变化.模型组Hyp含量于7 d 时高于对照组,28 d达到最高（P＜）.模型组MD酣量随时间延长而增加，其中14 d 时显着高于对照组（P＜）,但在28 d时有下降.SOD活力在7 d, 14 d均降低,28 d 时上升.模型组GSH/GSSG 3 d, 7 d显着低于对照组（P＜）,14 d, 28 d 乂回升. 结论:Hyp可作为博莱霉素诱导的肺纤维化的一个指标.博莱霉素诱导的大鼠肺 纤维化伴有氧化损伤，且在不同阶段细胞内、外的氧化抗氧化出现失衡. 【关键词】 肺纤维化；羟脯氨酸;氧化应激 0引言 肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病 ，目前的治疗方法尚 不能改善其不良的预后，加强对肺纤维化机制的研究，并在此基础上发展新的治 疗策略已成为更加迫切的现实需要.一般认为，在肺部，损伤组织及激发纤维化 的主要病理机制在于炎症和免疫反应，但是大量研究表明，氧自由基在炎症和免 疫介导的组织损伤中扮演了重要角色.故本研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤 维化模型,观察各氧化指标在此过程中的变化，从自由基理论的角度，深入探讨氧 化抗氧化失衡在该病发生发展中的重要作用. 1材料和方法 材料 博莱霉素A5,天津太河制药有限公司产品（批号:030305）,8 mg/支.丙 二醛（MDA标准品（Merk公司）;2Thiobarbituric acid（Merk 公司）;磷车乌酸（中国 医药集团上海化学试剂公司）;盐酸羟胺（AR,天津化学试剂一厂）；氯化硝基四氮 口坐蓝,NBT,NEMI（华美公司）;Triton X100（ 上海试剂一厂）;7210 分光光度计（上 海分析仪器厂虹桥分厂）;970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）;GL20A全 自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表离心机厂). 二级SD大鼠40只，雄性，体质量180~240 g,由第四军医大学实验动物 中心提供.随机分为模型组与对照组，每组20只. 方法 制备模型以10 g/L戊巴比妥钠(10 mg/kg, ip)麻醉大鼠，取仰卧固定位， 常规消蠹，行颈部正中切口，钝型分离暴露气管，于气管软骨环间隙穿刺注入 BLMA井理盐水溶液~ mL(5 mg/kg)，立即将动物直立并行旋转，缝合皮肤，待动物 自然活醒后置笼内常规饲养.对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS)注入气 管代之. 模型鉴定分别于气管内滴药后第3,7,14和28日处理.每批每组随机抽 出5只,麻醉处死.①剖开胸腔及颈部，分离气管和肺脏，结扎后取出肺脏，洗去血 渍，去除结缔组织，吸十水分；②从气管插管至左主支气管，结扎固定.分离结扎 右主支气管后离断，取右上叶置体积分数为40 g/L甲醛中固定1 wk,行HE和 Masson 染色. 肺脏羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp) 含量测定参考杨陟华等的方法， 将肺组织样品剪碎，置于磨口试管中，用6 mol/L HCl (W： V=1 ： 4)水解(125 C) 3 h后，稀释至10 mL,过滤.取滤液mL(空白管和标准管分别用蒸僻水和标准 Hyp 代替)加蒸僻水到mL,充分氧化，加入mL柠檬酸缓冲液(mol/L,pH )和mL氯胺 T溶液(mol/L)后6 min,用过氯酸(mol/L, mL)终止反应(静置5 min).加入100 g/L PDMAB mLT 80C水浴中保温10 min，显色完全后，自来水(25 C)冷却5 min. 最后用7210分光光度计在560 nm波长比色，测量其吸光度A值，用下式计算Hyp 含量：肺组织Hyp含量(mg/g)=( XA样/A标)/m.其中,A样为样品管吸光度,A标 为标准管吸光度网为肺重. 氧化损伤指标的测定剪取左肺，称质量,按1 ： 5加入生理盐水制备匀浆. 3000 r/min离心10 min,取上活，冻存备用.分别以八木国夫荧光法测定肺组织 脂质过氧化产物(MDA);改良盐酸羟胺法测定组织总