体外转录试剂盒说明书.docxVIP

实用标准文案 使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上 转录反应步骤和孵育 解冻冷冻的试剂 把 RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在 -20 。 vortex10 × reaction buffer 和 2× NTP/CAP 至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把 2 × NTP/CAP放在冰上， 10× reaction buffer 保存在室温， 所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。 室温下转录反应 如果反应在冰上进行， 10× reaction buffer 中的亚精胺可以与模板中的 DNA共沉淀， 离心管中加入水和核苷酸后再加入 10× reaction buffer 。 以下是一个 20ul 的反应体系，可按需要放大或缩小。 RNA长度为 300base-5kb 时采用以下反应体系 ( 用 0.1-0.2ug PCR 产物模板 或 0-1ug 线性质粒模板） 精彩文档 实用标准文案 对于更长或更短的转录，参考 20 页的“ Optimizing yield of long transcripts ’’和 “Optimizing yield of short transcripts ”部分。 当合成转录的长度大于 5 或 6KB 时，限制 GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。 为了避免这种情况， 可能需要补充额外的 GTP支持反应。 下面是添加特定体积的 GTP对普通 转录反应的影响。 （对于 T7 和 T3 试剂盒，提供的 GTP为 30mM。对于 SP6，为 20mM.） 应该添加多少额外的 GTP? 对于 5-8KB 的长度，我们建议最初测试加入 1ul 的 GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外 GTP确定所需的最小值。 添加 GTP将减少转录合成加帽的比例， 但将引起产量升高。 加帽转录的比例与反应中 GTP中 CAP的模拟物的比率成正比。 RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡 在网织红细胞溶解物中， 我们测试了 GTP不同比例的 CAP模拟物对转录反应的 RNA产量和产生 RNA的翻译效率的影响。（表 1） 网织红细胞球蛋白的 RNA的翻译依赖于 CAP。随着 GTP的 CAP模拟物增加， RNA的产量减少。 相反，合成的 RNA的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加，这反映了 5’端加帽的转录的 增加。注意 GTP的 CAP模拟物为 4:1 时提供了一个很好的 RNA产量和加帽效率的平衡。 没有 加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。 这些未加帽的转录很可能迅速 的被卵母细胞降解 。 除了加入不同比率的 m7G(5)ppp(5)G ， T7-mMESSAGE mMACHINE反应在标准条件下进行。 使用 1ug 的 T7 球蛋白模板 DNA37 度孵育 1h。球蛋白 RNA(6 μ g/mL) 在 25ul 的 Retic Lysate IVT? 进行翻译，加入 12.5 μ Ci of [35S] 蛋氨酸 (1200 Ci/mmol) ， 30°C 反应 60 min 。 测量 TCA-可沉淀 cpm 的量。 精彩文档 实用标准文案 彻底混匀 轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。 37 度孵育 1hr 一般来说， 孵育 1h 后可获得 80％合成。对于最大化合成， 建议孵育 2h。由于 SP6 反应稍微 慢于 T3 和 T7 反应，它们尤其可能受益于第 2h 的孵育。 对于合成《 300base 的转录和转录效率低下的模板，建议第二个小时的孵育。 如果反应是示踪标记：孵育后（ TURBODNase 处理前或处理后），通过 TCA共沉淀可等分的 放射性标记示踪反应来评价产量 (see step 5., “ Quantitation by trace radiolabeling ” on page 14) 5. 可选步骤 加入 1ul TURBO DNase， 37℃孵育 15min 。 DNase处理可清除模板 DNA，对一些应用来说并不必要，因为相对于 RNA来说，模板 DNA的 浓度非常低。 a. 加入 1ul TURBO DNase, 混匀 b.37 ℃孵育 15min RNA的回收 转录反应后所需要的净化程度取决于 RNA的用途。 以下是四种不同的方法， 根据你的用途选择一种或多种。 1.MEGAclear ? Kit 此试剂盒专为体外转录合成高产量的 RNA的纯化所设计。 快速、简单的去除 RNA中的核苷酸、 短的寡核苷酸、蛋白。回收的 RNA可用于任何需要高纯度 RNA的实验。 2. 氯化锂沉淀 氯化锂沉淀法是一种简单有效的