ITRAQ关键技术简述.docVIP

iTRAQ技术简述 1. 研究背景 1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electropho- resis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月Electrophoresis杂志上发表。伴随高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，大家不再满足于对一个细胞或组织蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛应用。 ?蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）和 基因组学（genomics）两个词组合体，表示“一个基因组所表示全套蛋白质”，即包含一个细胞乃至一个生物所表示全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表示绝大多数蛋白质或一个复杂混合体系中绝大多数蛋白质进行正确定量和判定。 蛋白质组本质上指是在大规模水平上研究蛋白质特征，包含蛋白质表示水平，翻译后修饰，蛋白和蛋白相互作用等，由此取得蛋白质水平上相关疾病发生，细胞代谢等过程整体而全方面认识。蛋白质组学是一门以全方面蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功效联络等方面进行探索科学。现在最新iTRAQ蛋白定量分析技术在此基础上被提出，并被得到广泛应用。 仅仅知道蛋白质身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质浓度对于实现其在细胞中功效来说极其关键，一个特殊蛋白质在浓度上改变，就能预示细胞突变过程。所以，科学家能够对蛋白质相对和绝对浓度进行测量，是很关键事情。过去，科学家通常优异行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是很敏感，也不是很正确。 新泽西医学及牙科大学蛋白组学研究中心主任Hong Li说：“当我们开始蛋白组学研究时，就采取2D凝胶技术，但得出信息量却让大家很失望，因为很多蛋白质已经改变了本身代谢过程，如热休克蛋白或是管家蛋白。” 蛋白组学中方法一直在不停提升。基于高度敏感性和正确性串联质谱方法，不需要凝胶，就能够取得相对和绝对定量蛋白质结果。定量蛋白组学是蛋白质组学一个关键组成部分，即对一对基因组表示全体蛋白或一复杂混合物体系中全部蛋白质进行定量和判定。常见定量蛋白质组学研究方法包含DIGE（difference gel electrophoresis）、iCAT（Isotope-coded affinity tag）和SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures)。 iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）是美国应用生物系统企业(Applied Biosystems Incorporation，ABI) 新开发一项蛋白定量技术。iTRAQ和iCAT是这些新进展中两大主力，不过，新技术也有不尽如人意地方，需要不停改善。 2. iTRAQ技术介绍 2.1技术介绍 iTRAQ技术是一个新、功效强大可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂基础上。 iTRAQ实际上是一个同位素标识试剂，包含一个带电荷汇报基团，汇报基团有4种相对分子质量分别为114、115、116和117，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团，平衡基团也有4种相对分子量分别为31、30、29和28。其中平衡基团平衡分子量，确保和每一个汇报基因结合后iTRAQ试剂总相对分子量全部是145，肽段反应基团能够同肽段N末端和赖氨酸测量E氨基基团发生反应，这么能够标识生物样品中产生全部肽段，增强任一给定蛋白肽段覆盖度，同时保留了诸如部分蛋白翻译后修饰关键结构信息。 2.2技术特点 该技术关键特点在于： 1.分离能力强、分析范围广； 2.定性分析结果可靠，可同时给出每一个组分分子量和丰富结构信息； 3.MS含有高灵敏度、检测限低； 4.分析时间快，分离效果好； 5.自动化程度高； 6.iTRAQ技术不仅可发觉胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD蛋白。 常见液相色谱仪是型号是日本岛津企业2D-nano-HPLC，质谱仪型号是美国ABI企业MALDI-TOF-TOF 4700，标识试剂盒是美国ABI企业ITRAQ标识试剂盒。所采取iTRAQ试剂是一个小分子同重元素化学物质，包含三部分：一端是汇报部分（reporter group ），另一端是肽反应部分（peptide reactive group），中间部分是平衡部分（balance group）。 其中，reporter g