第三章 分子克隆的载体[宣讲].pptVIP

第四节 粘粒载体 cosmid vector * 精品PPT | 借鉴参考 cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。 一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。 cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 * 精品PPT | 借鉴参考 柯斯质粒载体的特点 具有λ噬菌体的特性 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 具有质粒载体的特性 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 具有较高容量的克隆能力 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力 不能体内包装，不裂解受体细胞 重组操作简便，筛选容易 * 精品PPT | 借鉴参考 柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和λ噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb * 精品PPT | 借鉴参考 设计构建的柯斯质粒一般长5～7kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要其长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。 * 精品PPT | 借鉴参考 Formation of a cosmid clone C) Packaging and infect * 精品PPT | 借鉴参考 Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences. * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 采用柯斯质粒作载体的问题 ①载体自连。载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接； ②外源DNA片段自连。大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； * 精品PPT | 借鉴参考 ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 * 精品PPT | 借鉴参考 课堂作业: 什么叫α-互补,在载体构建中有何作用? * 精品PPT | 借鉴参考 第五节 人工染色体载体 Artificial chromosomes * 精品PPT | 借鉴参考 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 * 精品PPT | 借鉴参考 人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具 * 精品PPT | 借鉴参考 利用染色体的复制元件来驱动DNA片段复制的载体称为人工染色体载体 　酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） P1噬菌体载体和