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丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书 目的 采用 PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检 测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。 范围 适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。 职责 操作人员： 负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。 专业组组长 ：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方 面工作。 实验室主任 ：负责监督和指导实验室各方面工作。 原理 采用荧光 PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法 RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据 阈循环值 (CT)实现对未知样本的检测。 另外，本试剂盒带有内标物质， 用于对核酸提取的整个过程进 行监控，减少假阴性结果的出现。 5. 样本要求 适用标本类型 ：血清 标本采集 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 ml ，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂） ，室温 （ 22-25℃ ）放置 30-60min 血标本可自发完全凝集析出血清， 或直接使用水平离心机， 1500rpm 离心 5min ；吸取上层血清，转移至灭菌离心管。 标本保存和运送 所采集的标本可立即用于测试或长期保存于  -70℃ ，也可保存于  -20℃ 待测， 保存期为  3个月，标 本应避免反复冻融。标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过  4 天。 拒收标本： 拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。 仪器和试剂 设备 AB7500 核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。 试剂 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司 产品标准批号： YZB/国 7271-2013 最低检出量：最低检出量为 500 IU/ml 试剂各组分见表 1： 表 1 试剂盒组分表 组分名称 规 格 数 量 RNA 提取液 A 200 ul/ 管 1 核酸提取试剂 RNA 提取液 B 5 ml/ 瓶 2 DEPC HO 3 ml/ 瓶 1 2 HCV内标溶液 100 ul/ 管 1 PCR 检测试剂 HCV反应液 A 270 ul/ 管 1 HCV 反应液 B 30 ul/ 管 1 阴性质控品 200 ul/ 管 1 质控品 HCV 强阳性质控品 200 ul/ 管 1 HCV 临界阳性质控品 200 ul/ 管 1 操作步骤 试剂准备（试剂储存和准备区） 进入试剂准备区， 打开通风设备， 按照消毒清洁程序擦拭实验台面， 并在检验流程记录表上做相应 记录。 PCR反应液配制 HCV  A HCV  AB  8000rpm 取出  N个（N=  待测样本数  + 4  个 HCV 阳性定量标准品  +HCV 强阳性质控品  +HCV 临界阳性质控品  +阴 性质控品  +空白孔）  PCR反应管，  HCV单人份扩增体系配制见表  2： 表  2  PCR反应液配置表 组分  HCV反应液  A  HCV反应液  B  总体积 用量 /人份  27 ul  3 ul  30 ul 将各组分充分混匀， 混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，  之后将  30 ul  扩增体系 分装到 PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。 75%乙醇配制：取  ml  的 DEPC H2O，加入的无水乙醇，振荡混匀，配制成  75%乙醇，盖紧盖子，经 传递窗传递到标本制备区。 RNA 提取（标本制备区） 进入标本制备区，从传递窗中取出 PCR反应管和 75%乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。 从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、 RNA 提取液 A、RNA 提取液 和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。 打开金属浴，调节温度为 65℃，使仪器自动升温。 用镊子夹取 n 个 ml 灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。 （ n= 待测样本数 + 3 = 待测样本数 +HCV 强阳性质控品 +HCV 临界阳性质控品 +阴性质控品） 向离心管中各加入 10 ul 内标溶液，再分别加入 200ul 样本， 800 ul RNA 提取液 B，盖紧管盖，振荡 混匀 15s 以充分混匀，室温放置 5min （每隔 1min 旋涡振荡 5s，使裂解更充分，处理结束后瞬时离 心。） 加入 200 ul 无水乙醇，盖紧管盖，漩涡振荡混匀 15s 以充分混匀，瞬时离心，再加入 20 ul RNA 提 取液 A，漩涡振荡混匀 5s，室温静置 1min。 8000 rpm 离心 1min ，小心吸弃上清。 再加入 200 ul