第十二讲 DNA文库的构建[宣讲].pptVIP

基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 * 精品PPT | 借鉴参考 第二节 cDNA文库构建 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 * 精品PPT | 借鉴参考 1 概念 cDNA文库： 将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。 * 精品PPT | 借鉴参考 2 cDNA文库优点 ⑴ cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ⑵ cDNA文库的筛选比较简单易行。 ⑶ 每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。 ⑷可以在原核中表达。 * 精品PPT | 借鉴参考 3 对cDNA文库质量评价 3.1文库的代表性 文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNA片段的序列完整性。 * 精品PPT | 借鉴参考 4 cDNA文库构建的步骤 ⑴ 分离mRNA； ⑵ 富集mRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测重组噬菌体效价。 * 精品PPT | 借鉴参考 cDNA文库的构建： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%） 真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离； oligo(dT):polyA 杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 ②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。 * 精品PPT | 借鉴参考 4.3 第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。 cDNA第二链的合成的方法大致4种： 　自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物－衔接头合成法 * 精品PPT | 借鉴参考 ①自身引导合成法 获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 精品PPT | 借