抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法总结计划79498.docxVIP

抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法 一、 超氧化物歧化酶（ SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ，pH7.8) ： 母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g； 母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2 O（分子量 156.01） 31.2g。 分别用蒸馏水定容到 1000ml 。 0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至 1000ml 。 参考文献： 李合生主编：植物生理生化实验原理和技术 .高等教育出版社， 2000： 267～ 268。 2） 14.5mM 甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 1000ml 。 （ 3） 30μM EDTA-Na 2 溶液：取 0.001gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定容至 100ml 。 （ 4） 60μM核黄素溶液：取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100ml ，避光保存。 5）2.25mM 氮蓝四唑 (NBT) 溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml，避光保存。 酶液制备： 取 0.2g（可视情况调整） 样品（新鲜叶片或根系） 洗净后置于预冷的研钵中，加入 1.6ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液 （ pH7.8 ）在冰浴上研磨成匀浆， 转入离心管中在 4℃、 12000g 下离心 20min ，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 1）反应混合液配制 (以 60 个样为准 )：分别取 Met 溶液 162ml ，EDTA-Na 2 溶液 0.6ml ， 磷酸缓冲液 5.4ml ，NBT 溶液 6ml ，核黄素溶液 6ml, 混合后摇匀； 2）分别取 3ml 反应混合液和 30μl 酶液于试管中 （ 3）将试管置于光照培养箱中在  4000 lux  光照下反应  20min ； 同时做两支对照管，其中后测定作为最大光还原管，另  1 支试管取 3ml 反应混合液加入 30μl PBS（不加酶液）照光 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （ 4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）  调零后， 避光测  OD560( 出现颜色即 可测定 )。 （ 5）酶活性计算： SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50％所需酶量（ 测的样品值要 在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量 ）为 1 个酶活单位（ u）。 SOD 总活性＝ [( A ck-A E ) ×V]/ （ 1/2A ck×W× Vt ） SOD 比活力＝ SOD 总活性 /蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（ u/g FW ）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示； A ck 为照光对照管的吸光度； A E 为样品管的吸光度； V 为样品液总体积 （ ml,1.6ml ，加入 PBS 的体积 )； Vt 为测定时的酶液用量（ ml， 30ul ）； W 为样品鲜重（ g，测定时应换算为叶绿体的质量 mg）；蛋白质含量单位为 mg/g。 二、 POD、CAT 酶活性的测定 粗酶液制备同 SOD。 1、 过氧化物酶（ POD ）活性测定（愈创木酚法） （ 1）试剂配制： 0.2mol/L 磷酸缓冲液 (pH6.0) ：分别取 A 母液 (Na2HPO4 ) 123ml 和 B 母液 (NaH 2PO4 ) 877ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M ，pH6.0) ； （ 2）反应混合液配制（以 60 个样为准）： 取 200ml PBS(0.2M ，pH6.0) ，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（ 2-甲氧基酚）加热 搅拌溶解，冷却后加入 0.112ml 30 ％的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 （ 3）样品测定： 取 3ml 反应液并加入 30μl酶液，以 PBS 为对照调零， 而后测定 OD470 值（测定 40 秒）。 （边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话， 要保证每个样品从加好样到开 始记时的时间相差不大 ） （ 4）酶活性计算：以每 min OD 值变化（升高） 0.01 为 1 个酶活性单位（ u）。 POD= （ A470× Vt） /（ W× Vs×0.01 ×t） (u/g min) A470：为反应时间内吸光度的变化； W 为样品鲜重 (g) ；t 为反应时间 (m