核酸的抽取及杂交.ppt

核酸抽取及杂交;第一部分 DNA提取总论;一、提取DNA总的原则：;二、样本来源：;;DNA提取前样本采集、预处理和保存：;mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）;（二）血浆和血清;;血浆DNA;（三）体液;（四）分泌物;;三、DNA的收率;四、DNA提取的基本步骤;各种组织细胞破碎方法;破裂细胞 、释放核酸;2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液;;4、DNA鉴定;浓度鉴定; 各种碱基的紫外吸收光谱;;EB与DNA的结合 ;500?l全血提取的基因组DNA电泳;纯度鉴定;完整性鉴定;核酸抽取及杂交;5、核酸的贮存——DNA保存 ;第二部分 基因组DNA的分离与纯化;一、DNA样品准备;二、DNA提取;DNA酚抽提法示意图;;;;;为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？;;DNA的沉淀;;;DNA玻棒缠绕法示意图;核酸抽取及杂交;;二、DNA的浓缩;三、DNA回收 ;（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段;1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法;;;;;;核酸抽取及杂交;核酸抽取及杂交;（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段;至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。;DNA提取试验中常遇到的问题;;核酸抽取及杂交;质 粒 DNA 制 备plasmid extraction ;质粒简介;Chromosome DNA genome;;质粒特性;质粒的结构特点;Plasmid vectors;表达载体; ;质粒DNA的提取和纯化 ;;;二、细菌的收集(bacterial collection);三、细菌裂解;质粒提取的方法;质粒DNA提取方法的选择 ;;;四、细菌的裂解和质粒DNA的提取(bacterial and plasmid extraction);细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋 在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中; 1在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。 ?;;;碱裂解法示意图;1~4ml培养细菌收集;碱裂解法提取质粒的试剂及主要???分:(main regeants and components);核酸抽取及杂交;碱裂解提取质粒可能存在的问题;;（二）煮沸裂解法（boiling）;质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构 通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA;;（三）SDS裂解法; 由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。;（四）其它方法;1、 小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。 ; （二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。 由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。;质粒DNA的纯化;EB—CsCl密度梯度离心法;;EB—CsCl密度梯度离心法示意图;核酸抽取及杂交;;;3 柱层析法;核酸抽取及杂交;RNA的分离与纯化;;;组织材料;一、关于RNase酶;核酸抽取及杂交;去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。 必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。;;;1. 变性剂(denaturant) 选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂） 使用蛋白酶K(proteinase K) 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠;; 联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。;;（2）RNA酶的蛋白抑制剂;3.还原剂;RNA提取实验前的准备;三、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法;;四、商品化的单相裂解试剂法分RNA; 变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。 保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。;