Hplc测定内源激素[1].docVIP

Hplc测定内源激素 样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1-5个新梢的中部叶片4-6个，作好标记后存放于冰瓶中迅速带回实验室。在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。 激素的提取：称取0.15g由不少于4片叶子或其部分构成。将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷乙腈为浸提液，浸提三次，第一次加入5ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静止浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加入4ml，在振荡器上以230转/分速度振荡提取2小时后离心，第三次加入2ml提取液清洗残渣，离心，都倒入小玻璃瓶中。 第一次减压浓缩及溶解：将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入pH为8.0的0.4M磷酸缓冲液2ml和2ml三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。用3ml 0.4M磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏瓶，倒入小玻璃瓶中。 去除色素：首先将盛有溶解液的的玻璃瓶封口在振荡器上振荡20分钟，而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去,然后加入2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。如果水相中仍有色素可重复上一步进行第三次色素去除。 去除酚类杂质：对三氯甲烷萃取的水相溶液（体积计数），倒入离心管,加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),上下振荡，离心8000rpm,10min。 植物激素的萃取：移液器取上清液8ml，滴加纯甲酸直至pH试纸为3.0，（经验值100ul左右）往此水相中加入乙酸乙酯振荡（3ml），移液器提取酯相（上部）,其水相再用乙酸乙酯萃取两次（2ml,2ml）。合并所得酯相。 第二次浓缩及进一步纯化：所得酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干。蒸干物用1.0ml色谱流动相溶解。 溶解及过滤方法：由于最终溶解液1.0ml流动相即是HPLC上机样品，所以一定要在蒸馏瓶完全蒸干前提下一次性用移液管准确加入1.0ml，并充分溶解瓶内蒸干物质，尽量使瓶内溶液浓度均一，而后直接到入干燥无水的滤膜过滤器的针筒中进行加压并使溶液通过直径为0.45um的水相微孔滤膜，压滤液存放于1.5ml离心管中用于上机测定。 仪器准备：小玻璃瓶，7ml塑料离心管，1.5ml离心管，5ml 玻璃注射器，过滤头，0.45um或0.22uml滤膜，可调试移液枪 枪头