PCR实验室标本管理、生物安全与防污染综合策略.ppt

PCR实验室标本管理、生物安全和防污染综合策略;标本采集时间对扩增检测结果的影响;标本采集部位的准备;标本的类型和采集量;采集质量的评价;采样及运输容器;标本采集中的防污染 ;标本运送;;　　　　容器的使用;2.RNA标本处理和保存 对于RNA测定，标本 的 获取、处理和方式对测定结果有决定 性影响。研究表明，用于RNA测定的血浆 标本最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素， 因其对PCR扩增有几只，且很难在核酸提 取过程中完全去除），抗凝后6小时内分 离血浆保存 ???如使用血清标本，则需尽 快（2小时）分离血清后保存。保存时间 短时（1-2周）可放-20℃下，较长期时应 在-70℃下。 ;二、全血标本 以全血作为  待测标本时;三、外周血单个核细胞;四、痰;2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本的处理只能室温悬浮于生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 ;五、棉拭子;六、脓液; 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如过于粘稠，则加入适量生理盐水，充分振荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA提取；如为水样，则按上述直接离心取沉淀即可。 保存 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。;七、体液;八、组织;保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。;小结;PCR实验室标本管理、生物安全和防污染综合策略;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染与对策;PCR污染原因分析;PCR污染原因分析;关于PCR假阳性问题;PCR假阴性问题总体来说有如下因素： ; 作为参考指标，由于离心机的大小不同，有效离心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意这个问题。 ; ?? 试剂质量问题 PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Tap酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。 ;核酸模板问题;操作人员素质问题;生物安全柜的使用;II级生物安全柜 用于对人员、受试样本及环境进行保护且能满足生物安全柜危险度等级为1、2、3级的病原体操作的生物安全柜。II级生物安全柜的前窗开口区向内吸入负压气流用以保护人员的安全；经高效过滤器过滤的垂直气流用以保护受试样本的安全；排出气流经高效过滤器过滤是为了保护环境不受污染。;生物安全柜知识简介 II级生物安全柜 二级生物安全柜是目前应用最为广泛飞柜型，是有前窗操作口的安全柜，操作者可以通过前窗操作口在安全柜内进行操作，对操作过程中的人员、产品及环境进行保护。; 生物安全柜的使用 与注意事项 ;正确的使用生物安全柜 应遵循以下使用原则： 缓慢移动原则 物品平行摆放原则 避免震动原则 不同样品柜内移动原则 避免明火使用原则 定期进行安全柜防护效果的评估; 　生物安全柜操作程序;一、制定操作步骤、列出明细表、准备好所有材料 二、用杀菌肥皂清洗双手、戴手套；高危险性操作 要穿隔离服，戴两副手套，手套和工作服可在 进行实验时将保护你不受到操作中生物因子的 危害，也可以防止人体所携带寄生菌对安全柜 工作区和实验样品的污染。; 三、如果紫外灯正在工作，进入实验室后关闭紫外 灯，将前窗开至工作高度病开启荧光照明灯。 确保安全柜进气和排气区域没有物体阻碍或干 扰，开启安全柜的风机进行预热5分钟，这程 序可以清楚安全柜工作区内可能经空气传播的 污染物，并有助于稳定安全柜的气流。调节工 作椅的高度，是你的肩膀和前窗下缘平行，这 样可以确保你的面部在前窗的保护之下，病有 给予你足够的操作空间。; 四、使用适当的消毒液如70%的乙醇擦拭工作区表面包 括前