免疫组织化学技术[共55页].pptVIP

免疫组织化学技术;免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。; 基本原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。;免疫组化的特点 特异性强 敏感性高 定位准确、形态与功能相结合 ; 免疫组化的作用; 实验所用标本; 实验设备;;; ; 免疫组化技术分类;酶联免疫组织化学; 免疫组化操作步骤;一.石蜡切片制作;5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带 6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸） 7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h;二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤;2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性 3、PBS冲洗2-3次，每次5min 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温 5、PBS冲洗2-3次，每次5min 6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体 7、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min） 8、PBS冲洗2-3次，每次5min;9、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h 10、PBS冲洗2-3次，每次5min 11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h 12、PBS冲洗2-3次，每次5min 13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞） （显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）;14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检 ;三.二步法免疫组化染色步骤;;几种抗原修复方法;微波辐射抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。;高压抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。;电炉加热抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。;胰蛋白酶消化法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④PBS洗3次，1分钟/次。⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。⑥PBS洗3次，2分钟/次。⑦后按选好的免疫组