20202生物样品的预处理.pptVIP

BioPharm 挤压法 ? 微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突 然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。 ? 适用：细菌（革兰氏阴性菌） BioPharm 2.1.2 物理法 超声波破碎 ? 频率为 20kHz 以上的波，超过人耳可听范 围。其对细胞的破碎与空穴的形成有关。 – 空穴作用：在超声波作用下，使气泡形成、胀 大和破碎的现象。 ? 一般样品浓度、声强、频率、介质的离子 强度、 pH 、处理时间都对破碎有影响。 ? 微生物细胞条件 : 样品浓度 50 ～ 100mg/ml ，输出功率 100 ～ 200W ，破 碎时间 3 ～ 5 分钟，间歇操作，样品量 ≤ 40ml ，冰浴操作 BioPharm 超声破碎仪 BioPharm 渗透压冲击法 ? 高渗突然低渗，反复后可造成细胞破碎，促使内含物释放。 ? 适用：处理胞壁较脆弱的微生物。 反复冻融法 ? 将材料深冷（ - 15℃～ - 20℃），形成水晶，破坏胞膜疏水 键，增加亲水性，反复可破细胞。 ? 适用：动物材料 BioPharm 急热骤冷法 ? 将材料投入沸水，维持 85 ～90℃数分钟，冰浴中急速冷却， 使胞壁结构破坏。 ? 适用：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取 干燥法 BioPharm 2.1.3 化学法 溶剂处理法 ? 丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物， 使细胞结构破坏。 表面活性剂法 ? 添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜 而破碎细胞，释放目的物。 ? 此法常需与其它方法结合应用 BioPharm 生物样品的预处理 江南大学医药学院 BioPharm 初级分离阶段 Primary separation ? Primary separation 的任务 – 分离细胞和培养液 – 破碎细胞释放产物 – 溶解包含体 – 复原蛋白质 – 浓缩产物 – 去除大部分杂质 BioPharm 生物样品的预处理 ? 不同来源样品分离的预处理 – 植物组织提取物的制备 – 动物组织提取物的制备 – 细菌中重组蛋白的提取制备 ? 细胞的破碎与分离 – 常见的方法 – 细胞破碎技术的发展方向 BioPharm 1 不同来源样品分离的预处理 ? 样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物细胞 培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织提 取液等。 ? 生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素 等，因此对目标组分进行初步富集和分离，对干扰组分进 行初步去除等工作都属于预处理。 BioPharm 生物样品特征： ? 目标产物浓度普遍较低，悬浮液大部分是“水”，组分复 杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、 无机盐类等多种物质的混合物； ? 分离过程很容易发生失活现象， pH 、离子强度、温度等变 化常常造成产物的失活； ? 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染， 蛋白水解作用等。 BioPharm 分离过程注意点 ? 迅速加工，缩短停留时间 ? 控制好操作温度和 pH ? 减少和避免与空气接触受污染的机会 ? 总体设计好各组分的分离顺序 BioPharm 不同来源样品分离的预处理 1.1 植物组织中活性物质的提取 1.1.1 酶的提取 ? 植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取酶的过程变 得复杂。 ? 植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生 反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应 , 使目的 酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行 的步骤。 BioPharm 酚类化合物与蛋白质的结合方式 可逆结合 ? 酚类化合物的两个羟基与蛋白质分子形成氢键，例如肽键 的 CO 端和 NH 端 不可逆结合 ? 酚类化合物的两个相邻羟基被氧化为邻苯醌之后，通过共 价键与蛋白质分子中的自由氨基以及巯基结合 – 引起蛋白质活性基团集合，引起聚集、交叉结合和沉淀（酶促褐 变作用） BioPharm 预处理需要注意： ? 温度尽可能低 ? 提取液的量要保证 “ 充分浸入 ” ? 加入足量酚类吸附剂 ? 加入足量氧化酶抑制剂 ? 搅拌转速要恰当 ? pH 要控制在合适范围，一般 5.5 ～ 7 BioPharm 酚类吸附剂的种类： ? 天然和合成的聚合物 – 清蛋白 – 尼龙粉