- 1、本文档共6页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
PAGE
PAGE #/ 6
2.
9.3 -Galactosidase酶活定量实验
参考 Clontech Yeast Protocols Handboo进行。
酵母酶活测定,
准备:
每个样品,8 ml的YPD培养基,Y190菌株(转化用)。
Z buffer,Z buffe叶beta-巯基乙醇,Z buffe叶ONPG NA
2CO31准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌,同时将 ONPG 溶解在Z缓冲液中(4 mg/ml,调pH
7.0)并振荡混匀 1-2 hr;
2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡
0.5-1min,立刻取出2ml加入8ml的YPDA中;
3) 30C 250 rpm 摇 3-5 hr,测 OD
600 在
0.5-
0.8之间并记录确切OD值;4)取3个
ml的EP分别倒入
ml菌液,14,000 rpm离心30 sec,小心弃上清,加入
ml Z缓冲液,振荡以重悬菌体;
5)离心去上清,加入300 ^IZ缓冲液重悬菌体(则浓缩倍数为倍);6)取
0.1 ml 至新管中,液氮冷冻
0.5-1 min, 37C
0.5-1 min 使其融化; 7)反复冻融 3次以上使细胞尽可能破碎;
8) 取一个新管加入100 "Z缓冲液作为空白对照;
9) 每管中加入
0.7 ml Z缓冲液+怜巯基乙醇,加入160山溶在Z缓冲液中的ONPG同时开始 计时,将管置于30 C温浴;
10) 当溶液变为黄色时,加入
0.4 ml Na
2CO
3中止反应,计录反应时间t; 11)14,000 rpm离心10 min,取上清,测OD
420 值;
12)计算 伕Galactosidase酶活:
伕Galactosidase units=1,000 x OD
420 (t x Vx OD
600)
t 为反应时间(第 10步记录)
V为
0.1浓缩倍数(第5步记录)
OD
600为第3步所测OD值
2.9.4提取酵母蛋白
参考 Clontech Yeast Protocols Handboo进行。
1)接酵母菌于SD/-Leu /-Trp培养基中,30C摇培过夜;2)扩培至50 ml YPDA 培养基中,30 C摇培至OD
600 为
0.4-
0.6,计算总 OD
600 值:
测得的 OD
600值>培养液体积;
3) 将菌倒入预冷的离心管中,4C 1000 x g5 min弃上清,细胞重悬于50 ml 预冷的超纯水中;
4) 4C 1000 x g5 min弃上清,冷的超纯水再洗一次,沉淀冻到液氮中,继续 下面的实验或冻存于-80 C ;
5) 每
7.5OD
600加入100卩160预热的裂解缓冲液(用前加入 PMSF和 cocktail,因 PMSF有半衰期,需每隔7 min补一次),600水浴小于2 min使菌体融化并重 悬起来;
6) 转移到
1.5ml的EP管中,加入适量 glassbeads (80卩l/
7.5OD
600), 700 10 min,剧烈振荡 1 min;
7) 40 14,000 rpm离心5 min,将上清转移至新的EP管中并置于冰上;
8) 沉淀置于 100C3-5 min,剧烈振荡 1 min, 4C 14,000 rpm 离心 5 min,小 心吸取上清,并将两次的上清合到一起;
9) 100C 10 min 煮样,即可进行 western blot。
试剂配置
YPDA培养基:1 L配方:20 g Difo peptone, 10 g Yeast extract 15 ml
0.2% adenine hemisulfate solution,加水至 950 ml,灭菌后冷却至 55C再加 入50 ml 40%的葡萄糖(葡萄糖溶液可112C灭菌或抽滤灭菌),若为固体培养 基灭菌前还需加 20 g/L Agar;
SD/-Leu/-Trp 培养基:
6.7g/LYeastnitrogenwithoutaminoacids,
0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplemen,若为固体培养基需加 20g/L Agar,灭菌;
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 培养基:
6.7 g/L Yeast nitrogen withoutamino acids,
0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp DO suppleme n,若为固体培养基需加 20 g/L Agar,灭菌;
贮存液:10X TE
0.1MTris-HCI, 10mMEDTA 调 pH
灭菌,
10 x LiAc 1 M LiAc,乙酸调 pH
灭菌,
50% PEG400;0
PEG/LiAc: 40% PEG,1 x TE1 x LiA
您可能关注的文档
- 小学音乐《久不唱歌忘记歌》教案3.docx
- 小学音乐《北京喜讯到边寨》教案.docx
- 小学音乐《好朋友》教学设计与反思.docx
- 小学音乐《小号手之歌》教案3.docx
- 小学音乐《快乐的罗梭》教案1.docx
- 小学音乐《打字机》教案.docx
- 小学音乐《捉泥鳅》教案3.docx
- 幼儿园中班社会《鸡妈妈生病了》.docx
- 幼儿园大班升旗稿我有一双勤劳的手.docx
- 幼儿园大班学前班期末评语.docx
- 浙江省杭州市夏衍中学招考聘用编外教师笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 四川2023年12月四川南充公务员考试(757人)2024年国家公务员考试考试大纲历年真题笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 江苏扬州高邮市招考聘用社区工作者(“两新”组织党务工作者)24人笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 江西2024年01月江西公务员考试(7504人)国家公务员考试消息笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 河南2024年01月河南公务员考试南阳考区确认及缴费重要提醒国家公务员考试消息笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 四川省自然资源厅考试转任机关工作人员6人2024年国家公务员考试考试大纲历年真题43534笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 四川阿坝小金县面向县外考调机关事业单位工作人员5人2024年国家公务员考试考试大纲历年真题41笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 新疆喀什地区地县直机关遴选及选拔公务员2笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 江苏宿迁泗阳县县直机关事业单位选调4人2024年国家公务员考试考试大纲历年真题1笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
- 浙江2023年12月浙江台州三门县人民政府办公室选调公务员2024年国家公务员考试考试大纲历年真题笔试近6年高频考题难、易错点荟萃答案带详解附后.docx
文档评论(0)