总结-酵母酶活测定.docx

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PAGE PAGE #/ 6 2. 9.3 -Galactosidase酶活定量实验 参考 Clontech Yeast Protocols Handboo进行。 酵母酶活测定, 准备: 每个样品,8 ml的YPD培养基,Y190菌株(转化用)。 Z buffer,Z buffe叶beta-巯基乙醇,Z buffe叶ONPG NA 2CO31准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌,同时将 ONPG 溶解在Z缓冲液中(4 mg/ml,调pH 7.0)并振荡混匀 1-2 hr; 2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡 0.5-1min,立刻取出2ml加入8ml的YPDA中; 3) 30C 250 rpm 摇 3-5 hr,测 OD 600 在 0.5- 0.8之间并记录确切OD值;4)取3个 ml的EP分别倒入 ml菌液,14,000 rpm离心30 sec,小心弃上清,加入 ml Z缓冲液,振荡以重悬菌体; 5)离心去上清,加入300 ^IZ缓冲液重悬菌体(则浓缩倍数为倍);6)取 0.1 ml 至新管中,液氮冷冻 0.5-1 min, 37C 0.5-1 min 使其融化; 7)反复冻融 3次以上使细胞尽可能破碎; 8) 取一个新管加入100 "Z缓冲液作为空白对照; 9) 每管中加入 0.7 ml Z缓冲液+怜巯基乙醇,加入160山溶在Z缓冲液中的ONPG同时开始 计时,将管置于30 C温浴; 10) 当溶液变为黄色时,加入 0.4 ml Na 2CO 3中止反应,计录反应时间t; 11)14,000 rpm离心10 min,取上清,测OD 420 值; 12)计算 伕Galactosidase酶活: 伕Galactosidase units=1,000 x OD 420 (t x Vx OD 600) t 为反应时间(第 10步记录) V为 0.1浓缩倍数(第5步记录) OD 600为第3步所测OD值 2.9.4提取酵母蛋白 参考 Clontech Yeast Protocols Handboo进行。 1)接酵母菌于SD/-Leu /-Trp培养基中,30C摇培过夜;2)扩培至50 ml YPDA 培养基中,30 C摇培至OD 600 为 0.4- 0.6,计算总 OD 600 值: 测得的 OD 600值>培养液体积; 3) 将菌倒入预冷的离心管中,4C 1000 x g5 min弃上清,细胞重悬于50 ml 预冷的超纯水中; 4) 4C 1000 x g5 min弃上清,冷的超纯水再洗一次,沉淀冻到液氮中,继续 下面的实验或冻存于-80 C ; 5) 每 7.5OD 600加入100卩160预热的裂解缓冲液(用前加入 PMSF和 cocktail,因 PMSF有半衰期,需每隔7 min补一次),600水浴小于2 min使菌体融化并重 悬起来; 6) 转移到 1.5ml的EP管中,加入适量 glassbeads (80卩l/ 7.5OD 600), 700 10 min,剧烈振荡 1 min; 7) 40 14,000 rpm离心5 min,将上清转移至新的EP管中并置于冰上; 8) 沉淀置于 100C3-5 min,剧烈振荡 1 min, 4C 14,000 rpm 离心 5 min,小 心吸取上清,并将两次的上清合到一起; 9) 100C 10 min 煮样,即可进行 western blot。 试剂配置 YPDA培养基:1 L配方:20 g Difo peptone, 10 g Yeast extract 15 ml 0.2% adenine hemisulfate solution,加水至 950 ml,灭菌后冷却至 55C再加 入50 ml 40%的葡萄糖(葡萄糖溶液可112C灭菌或抽滤灭菌),若为固体培养 基灭菌前还需加 20 g/L Agar; SD/-Leu/-Trp 培养基: 6.7g/LYeastnitrogenwithoutaminoacids, 0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplemen,若为固体培养基需加 20g/L Agar,灭菌; SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 培养基: 6.7 g/L Yeast nitrogen withoutamino acids, 0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp DO suppleme n,若为固体培养基需加 20 g/L Agar,灭菌; 贮存液:10X TE 0.1MTris-HCI, 10mMEDTA 调 pH 灭菌, 10 x LiAc 1 M LiAc,乙酸调 pH 灭菌, 50% PEG400;0 PEG/LiAc: 40% PEG,1 x TE1 x LiA

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