四种血清型副猪嗜血杆菌分子检测方法的建立.pdf

摘要 摘 要 副猪嗜血杆菌（Haemophlius parasuis ，HPS ）可以导致猪格拉瑟氏病，同时 会引发肺炎等相关疾病，是呼吸道疾病相关的主要致病菌之一，在经济方面及养 猪的品质方面带来极大损害；因此，快速诊断该菌及鉴别该菌不同血清型菌株日 益重要，在检测该病时，需要一定的方法及策略。传统检测分型一般操作冗杂， 仪器贵不实用，在个体、基层或微企业很难应用。而环介导等温扩增技术 （loop-mediated isothermal amplification, LAMP ）使用方便，价格低廉，所以建 立LAMP检测方法，用于HPS 的分型就显得日益重要，它不仅能在现场时刻进行 检测，同时也能大量进行普及推广。主要内容如下： 1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定 在中国河南周边地区调查收集疑似的病料组织，共计813 份样品进行分离鉴 定，这些病料来自于发病猪，这些猪的肺脏、关节、脑脊液等样品具有 HPS 病 典型的临床特征。培养分离该菌的TSA 培养基必须添加生长因子NAD ，以及犊 牛血清，培养之后进行分离与鉴定。经常规检测操作革兰氏染色试验，在附以 PCR 方法对分离的菌株进行分子鉴定，取阳性 PCR 产物送去测序与分析，经过 比对分析，阳性菌株扩增序列与国内外 HPS 核苷酸相似性高达 98.6%~99.9% ， 在氨基酸方面相似性为 99.0%~100.0% ，分离出的副猪嗜血杆菌共 63 株。HPS 总共分离率的数量为 7.75% （63/813 ），在这 3 年期间的分离率介于 5.49%(13/237)~11.31% （19/168）。 2. 四种血清型副猪嗜血杆菌PCR 检测方法的建立 基于不同血清型副猪嗜血杆菌的荚膜多糖基因座内的基因序列差异，可快速 进行分子血清型分型。分别建立快速检测HPS 1 、4 、5、11 型的单一PCR 检测 方法，通过优化引物浓度、退火温度等，1、4 、5 、11 型副猪嗜血杆菌的 PCR 检测结果依次显示为：引物最适浓度分别为 0.3 µM 、0.4 µM 、0.4 µM 、0.4 µM ，反应的最适退火温度分别为 51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃时，四种血清型 PCR 反应体系检测效果最佳。利用本实验建立的方法分别检测四种血清型副猪 嗜血杆菌、其它血清型副猪嗜血杆菌及其他种属细菌病毒，Hps 1 、4 、5、11 型 PCR 中分别仅扩增出180 bp、320 bp、450 bp 、890 bp 单一目的条带，没有非特 异性扩增，表明 PCR 方法扩增单一特异。对重复性方面、敏感性方面进行了检 测；结果表明，1、4 、5、11 型 PCR 方法最低检测限分别为 13.5 pg/µL 、24.1 pg/µL 、17.1 pg/µL 、14.9 pg/µL ，具有较好的稳定性。 I 摘要 3. 四种血清型副猪嗜血杆菌mPCR 检测方法的建立 本研究依据 HPS 1、4 、5、11 型分别对应的 funB、wciP 、wcwk 、amtA 基 因序列各设计一对引物，同时选取四种血清型的保守序列HPS 16S rRNA 基因序 列，采用软件设计引物，通过比较分析引物二聚体、互补性分析及同源性，分别 依次构建了检测HPS 1 、4 、5、11 型的mPCR 方法；通过PCR 条件的摸索，在 此基础上优化双重 PCR 的反应体系、条件，一般包含退火温度、引物浓度等的 优化，检测分析了敏感性、特异性