小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨-细胞生物学论文-生物学论文.docx 13页

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  • 2021-01-14 发布

小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨-细胞生物学论文-生物学论文.docx

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    小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨-细胞生物学论文-生物学论文 ——文章均为WORD文档,下载后可直接编辑使用亦可打印——   卵泡是卵巢内的基本功能单位,包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞〔1〕。卵泡膜间质细胞 ( theca -interstitial cells,TIC) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞,它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用〔2 -4〕,同时作为卵巢微环境的主体成分之一,TIC 参与了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病〔6〕的发生发展。为了能够进一步深入研究 TIC 对卵巢功能的影响及其作用机制,在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与TIC 相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵泡的培养主要包括二维法和三维法,而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。本研究拟采用海藻酸钠凝胶 ( alginate hydrogel,ALG) 和 Transwell 构建 3种共培养模型,从卵泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌水平和减数 恢复情况等方面进行综合评价,旨在探索一种最佳的共培养方法。   1 材料和方法   1. 1 实验动物 由武汉大学动物实验中心提供 SPF级 C57BL/6 小鼠,动物处理过程遵守动物保护与使用原则,并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。   1. 2 主要试剂 Lebovitz's L -15 培养基( Invitrogen) 、-MEM 培养基 ( Hyclone) 、注射用重组人促卵泡激素( Merck serono) 、FBS( Gibco) 及 hCG( 赤峰博恩药业有限公司) ,其他试剂均购自 sigma 公司。   1. 3 卵泡膜间质细胞的分离与培养 分离 21 ~ 25 日龄 C57BL/6 雌鼠的卵巢,针刺以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液( McCoy's 5a 培养基 +4 mg/ml 胶原酶Ⅳ +10%胎牛血清) 37℃消化 1 h,每 15 min 吹打 1 次。将消化好的细胞 悬 液 进 行 离 心 ( 1 000 rpm,5 min) ,并 用McCoy's 5a 培养基清洗 1 次。最后所得的细胞用 TIC 培养基 ( McCoy's 5a 培养基 +10% 胎牛血清 +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 重悬,接种于 24 孔板或 Transwell 滤膜 ( Corning,#3422) 底侧面 ( 倒置于 12 孔板中) ,每孔细胞数约为 1 105个,置于37℃ 、95% O2~ 5% CO2培养箱中培养 24 h,细胞贴壁后将 Tranwell 按正常位置置于24 孔板中,加入 TIC培养基。   1. 4 窦前卵泡的分离 用 29 号胰岛素针针头针刺14 ~ 16 日龄 C57BL /6 雌鼠的卵巢,分离得到窦前卵泡,置于维持液 ( -MEM 培养基 +1%FBS +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 中,37℃、95% O2~5% CO2培养箱中孵育 30 min。选择具备以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培养: ①直径在110 ~140 m之间; ②具有完整连续的基底膜,无明显因操作造成的卵泡损伤; ③卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞; ④无明显窦腔形成。   1. 5 卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养      1. 5. 1 海藻酸钠凝胶法 将卵泡膜间质细胞接种于 24孔板底部,孵育过夜,更换卵泡生长培养基 ( - MEM培养基 + 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) ,600 l/孔。将 5 个窦前卵泡转移至 2% ( w/v) 无菌海藻酸钠液珠中,充分浸入包埋液 ( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl) 中交联2 min形成凝胶,再将海藻酸钠胶珠置入 24 孔板内,记为共培养第零天。   1. 5. 2 Transwell 间接接触法 将卵泡膜间质细胞接种于 24 孔板底部,更换 500 l 卵泡生长培养基,放入 Transwell 小室,加入 100 l 卵泡生长培养基,直接吸取 5 个卵泡转移至上室内。   1. 5. 3 Transwell 直接接触法 将培养于 Transwell 小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于 500 l 卵泡生长培养基中,直接吸取 5 个卵泡转移至含 100 l 卵泡生长培养基的上室内。   1. 5. 4 培养基更换 每组包含 20 ~ 30 个卵泡,于37℃ 、95% O2~ 5% CO2培养箱中培养

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    • 内容提供方:天降财神
    • 审核时间:2021-01-14
    • 审核编号:5232041321003110

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