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植物组织超氧阴离子自由基含量测定 实验原理 超氧阴离子是植物体内重要的信号分子，同时，在逆境环境或细胞衰老时，氧作为电子传递的受体，易得到单电子而形成超氧阴离子。它是细胞内生成的第一个氧自由基，能启动自由基连锁反应，经过一系列反应转化生成过氧化氢、羟自由基、单线态氧等其它的氧自由基，最后导致植物细胞的氧化损伤。 利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。超氧阴离子与羟胺反应生成亚硝酸根，亚硝酸根在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中超氧阴离子含量。 实验仪器 高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。 实验试剂 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；10mmol/L盐酸羟胺；17mmol/L对氨基苯磺酸；7mmol/L α-萘胺；5μg/mL亚硝酸钠标准液 实验材料 小麦叶片 实验步骤 1、亚硝酸根标准曲线制作 按照下表分别加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水： 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 亚硝酸钠标准液(mL) 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 蒸馏水(mL) 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 亚硝酸钠含量（μg/mL） 0 0.625 1.25 1.875 2.5 3.125 3.75 4.375 5 亚硝酸根含量（nmol/mL） 0 9.06 18.12 27.17 36.23 45.29 54.35 63.41 72.46 1号管为调零管，亚硝酸钠标准液和蒸馏水加入完毕后，各管再加入显色剂（对氨基苯磺酸和α-萘胺各1mL），置于25℃显色15min，然后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管的吸光值。最后以1-9号管亚硝酸根含量为横坐标，吸光度值作纵坐标，求出方程式标准曲线回归直线。 2、超氧阴离子含量测定 （1）提取液制备：称取1g小麦叶片放入研钵中，加入少许预冷的50mmol/L磷酸缓冲液（PH7.8），研磨成匀浆，最后定容至5mL，摇匀后，在4℃，3000r/min下离心10min，取上清液，在4℃,12000r/min下离心20min，取二次上清为提取液。 （2）取4支试管，按下表加入溶液 1 2 3 4 提取液（mL） 0 1 1 1 蒸馏水（mL） 1 0 0 0 磷酸缓冲液（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 盐酸羟胺（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 溶液加好后，在25℃下反应0.5h，然后再加入显色剂对氨基苯磺酸和α-萘胺各1mL混匀，置于25℃下显色15min，最后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管吸光值。 六、实验结果及计算 （1）标准曲线结果： 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 亚硝酸根含量（nmol/mL） 0 9.06 18.12 27.17 36.23 45.29 54.35 63.41 72.46 吸光值A530 调零 0.114 0.261 0.397 0.483 0.635 0.707 0.777 0.882 标准曲线回归方程为：y=0.011x+0.047(吸光度值为y，亚硝酸根含量为x) （2）超氧阴离子结果： 试管号 1 2 3 4 A530 调零 0.066 0.077 0.077 求平均值得A530为0.073。通过标准曲线回归方程求得亚硝酸根含量为2.36nmol/mL ，反应体系中提取液为1mL，故反应体系中中亚硝酸根含量为2.36nmol。 结果的计算方法 亚硝酸根含量（nmol/g Fw）=(C标xVt)/(WxVs) C标：根据标准曲线计算得到的亚硝酸根含量（2.36nmol）； Vt ：提取超氧自由基时的定容体积（5mL）； Vs：测定氧自由基含量时所用提取液体积（1mL） W： 样品鲜重（1g） 超氧阴离子含量（nmol/g Fw）=2x(32/46)x亚硝酸根含量 经计算得超氧阴离子含量为16.417 nmol/g Fw 注意事项 如果样品中含有大量叶绿素将会干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素。