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探讨IL-37对单核巨噬细胞的泡沫化的作用及机制-病理学论文-基础医学论文-医学论文 ——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——　　动脉粥样硬化（ＡＳ）是一种累及全身血管的慢 性病变。ＡＳ不仅仅是脂质代谢紊乱，同时也是一种慢性炎症性疾病，多种免疫细胞及细胞因子参与了其发生与进展。单核细胞迁移到内皮下转化为具有吞噬作用的巨噬细胞，通过清道夫受体（ｓｃａｖ－ｅｎｇｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＳＲ）吞噬脂质形成泡沫细胞，释放一系列炎性因子及趋化蛋白，启动炎症级联反应，促进ＡＳ进展。此外，泡沫细胞沉积于内皮下，导致内膜进一步改变。白细胞介素（ＩＬ）被认为是调节ＡＳ进展中泡沫细胞形成的关键因素。　　ＩＬ－３７能够抑制多种炎性因子的表达，平衡体内促炎因子与抑炎因子，抑制树突状细胞的活化，减轻炎症 反应。有实验在ＡＳ组织泡沫细胞中检测到ＩＬ－３７蛋白表达，但其能否影响单核巨噬细胞的泡沫化尚未明确。本研究以人单核细胞系ＴＨＰ－１为对象，体外模拟巨噬细胞泡沫化的过程，观察ＩＬ－３７的作用，并对可能机制进行探讨。　　１材料与方法　　１．１材料　　ＴＨＰ－１细胞系购自美国ＡＴＣＣ公 司，ＲＰＭＩ１６４０及胎牛血清购 自Ｇｉｂｉｃ公 司，ｏｘ－ＬＤＬ购 自Ｙｉｙｕａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，小鼠抗人ＡＢＣＡ－１单克隆抗体（ｓｃ－５８２１９）购自美国ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ公司，－Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８）购自美国ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ公司，兔抗人ＣＤ３６单克隆抗体购自美国ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司，小鼠 抗 人ＳＲ－Ａ单克隆抗体购自美国Ｒ＆Ｄ公 司，Ｔｒｉｚｏｌ及ＲＴ－ＰＣＲ试 剂 盒 购 自 日 本Ｔａｋａｒａ公 司，ＣＤ３６引物、ＳＲＡ引物、ＡＢＣＡ－１引物、ＧＡＰＤＨ引物由中国武汉擎科生物公司设计合成。　　１．２方法　　１．２．１　ＴＨＰ－１细胞培养ＴＨＰ－１细胞为悬浮生长细胞，用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养基，培养基加入青霉素（１００Ｕ／ｍｌ）和链霉素（１００ｇ／ｍｌ），３７℃、５％ ＣＯ２培养箱中静置培养，每２～３ｄ传代１次。　　１．２．２巨噬细胞的分化１　０００ｇ、５ｍｉｎ离心上述培养的ＴＨＰ－１细胞，弃上清，按１１０６／ｍｌ重悬于新的培养基中，接种到６孔板或者细胞培养瓶中，加入ＰＭＡ（终浓度为１６０ｎｍｏｌ／Ｌ），３７℃、５％ＣＯ２培养箱中静置培养２４ｈ，观察细胞贴壁和形态改变。　　１．２．３分组及建立泡沫细胞模型ＴＨＰ－１细胞（１１０６／ｍｌ）在１６０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＡ刺激２４ｈ分化为巨噬细胞，然后分别给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（５ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（２０ｎｇ／ｍｌ）。各组细胞均置５％ ＣＯ２、３７℃孵箱，培养２４ｈ。其中仅给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）单独刺激的对照组再进行进一步分组实验，一组给予ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ），另一组仅更换新鲜培养基，２４ｈ后收集细胞。　　１．２．４油红Ｏ染色观察泡沫细胞形态将ＴＨＰ－１培养于放有盖玻片的６孔培养板内，用ＰＭＡ刺激２４ｈ后，加入ｏｘ－ＬＤＬ和（或）ＩＬ－３７干预２４ｈ。待处理结束后，弃上清，用预冷ＰＢＳ液冲洗３次。４％多聚甲醛固定２～４ｍｉｎ，０．３％油红Ｏ染色液染色１５～２０ｍｉｎ，苏木素染色５ｍｉｎ，盐酸酒精分色，明胶甘油封片，显微镜观察。收集图像并用图像分析系统分析。　　１．２．５细胞内脂质测定弃干预后的细胞培养液，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，冰浴３０ｍｉｎ，用细胞刮刮下细胞，８００ｇ离心１０ｍｉｎ，加入０．５ｍｌ的氯仿－甲醇（２∶１）混合液研磨，３　０００ｇ、４℃离心３０ｍｉｎ，取上清液，加两倍体积的冰生理盐水，３　０００ｇ离心３０ｍｉｎ，去除上层液体，将下层有机相转移到干燥的ＥＰ管，用ＴＣ试 剂 盒 测 定ＴＣ，沉 淀 用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　０．２ｍｌ溶解，ＢＣＡ法测细胞内蛋白质含量。细胞内胆固醇含量用每克蛋白所含的ＴＣ表示。　　１．２．６　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＮＡ提取上述干预后的细胞，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，每孔加入１ｍｌ　Ｔｒｉｚｏｌ，静置１０ ｍｉｎ，用枪吹打 数次，吸入无ＲＮＡ酶 的１．５ｍｌ　ＥＰ管中，每管加入２００ｌ氯仿，震荡数秒，室温静置１０ｍｉｎ，１２　０００ｇ、１５ｍｉｎ，４℃，离心；吸取上层液体层２００～３００ｌ到另一ＥＰ管中，等体积加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，－２０℃，放置１０ｍｉｎ，１２　０００ｇ、１５ｍｉｎ，４℃离心；弃上清，加入１ｍｌ预冷无水乙醇，７　５００ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，离心；尽最大