血清清球蛋白分离(新).pptVIP

* 所有纤维膜完全湿透后才能开电源。 * * 染色液回收，漂洗液倒掉。 * * 1.离心机要在天平上配平。2.先把缓冲液液面降至略高胶床面，确保胶床不暴露于空气中，以免稀释蛋白溶液。3.用滴管吸取沿管壁缓慢加入，避免冲起胶床。4.做好标记，不要混淆清蛋白和球蛋白。5.不要错过蛋白质收集的机会。峰值判断：第二滴沉淀远明显于第一滴时。 * * 生物化学与分子生物学实验教学中心 血清清球蛋白分离(新) * 实验目的 掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 了解柱层析技术 实验分组 四个人一小组 * 实验过程 盐析（粗分离） 葡聚糖凝胶层析（脱盐） DEAE纤维素离子交换层析（纯化） 醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） * 实验材料 人混合血清 葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl2溶液 氨基黑染色液 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 * 实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 * 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 蛋白质的理化性质 常用的纯化方法 分子质量 透析、超滤 凝胶层析★ 离心 溶解度 调整pH 调整离子强度★ 降低介电常数 电荷 电泳★ 等电聚焦 离子交换层析★ 特异结合部位 亲和层析 其他性质 吸附层析 液相层析 气相层析 * 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.3 相对分子量（×104） 6.9 20 30 9~15 15.6~30 含量（％） 57~67 2~5 4~9 6.2~12 12~20 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A * 1. 粗提（盐析法） 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 血清清蛋白 球蛋白 半饱和硫酸铵 清蛋白不沉淀，上清 球蛋白沉淀，蒸馏水溶解 盐析法 盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。 水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 * 2. 脱盐（凝胶层析） 盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。 脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。 凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 凝胶层析分离示意图 * 凝胶层析分离化合物示意图 * 3.纯化（离子交换层析） 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离 R-SO3-H+ + Pr+ R-SO3-Pr+ + H+ 阳离子交换 阴离子交换 R-N+R3OH- + Pr - R-N+R3Pr - + OH- * 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.3 相对分子量（×104） 6.9 20 30 9~15 15.6~30 含量（％） 57~67 2~5 4~9 6.2~12 12~20 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A 0.06mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白pI 4.9，带负电荷多 a、b球蛋白pI 5.0～5.2， 带负电荷少 a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附 0.02mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5 ，带负电荷 g–球蛋白pI ＞6.5， 带正电荷 清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附, g-球蛋白被洗脱 0.3mol/LNH4Ac pH6.5 DEAE带正电荷 缓冲液离子强度增加 清蛋白被洗脱 * * 4.纯度鉴定（电泳） 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果 * 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.3 相对分子量（×104） 6.9 20 30 9~15 15.6