重组dna技术幻灯片.ppt

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第七章 重组DNA技术;第一节 基 本 概 念;重组DNA技术: 是指在基因水平上,将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上,然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生,以获得大量的目的DNA片段,或以此为基础,通过基因的诱导表达,得到大量相应蛋白质产物的过程。 又称为分子克隆技术或基因工程技术;第二节 重组DNA技术的发展史;基因工程的诞生;第三节 工具酶;Werner Arber 理论预见限制酶;;Ⅰ型酶、Ⅲ型酶: 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。;识别位点???即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。; ① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头(钝性末端);5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ):; 2、DNA连接酶; 3、DNA聚合酶Ⅰ ;(5) DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow 片段) 为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段,分子量为76 kD,这个片段也称为Klenow片段(Klenow fragment) 它除了保留5ˊ→3ˊ聚合酶活性及3ˊ→5ˊ外切酶活性外,失去了5ˊ→3ˊ外切酶活性。 常用于cDNA第二链合成,双链DNA 3ˊ端标记等。; (1)5’端标记 (2)制备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止载体自身 连接,提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠碱性磷酸 酶(CIP)。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活,故CIP较为常用。;催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用:探针标记,标记测序以及制备人工黏性末端。;第四节 重组DNA技术常用载体; 是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。;1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数,易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点(多克隆位 点,MCS)。 5、具有较高的遗传稳定性。; 这些载体均需经人工构建,除去致病基因,并赋予一些新的功能:如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。;1、质粒(plasmid):;pBR322质粒载体 ①相对分子质量小,长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点(ori)及与DNA复制有关的序列,赋予该质粒复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。; 是感染细菌的一类病毒,寄生于细菌中,并能溶解细菌细胞,故称噬菌体。 ;噬菌体生活周期;4、病毒;第五节 重组DNA技术; 基本步骤 ;1、 制备目的基因;(2)构建基因组DNA文库:;(3)构建cDNA文库: ;(5)直接用限制性内切酶切取、分离: 对一些物理图谱已经确定,背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组,可直接用限制性内切酶消化后,通过分离获得目的基因。; 2、克隆载体的选择和构建 ; 由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割形成互补的黏性末端。经退火后,由DNA连接酶连接。; 平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用 下相连接,但连接效率较低。为提高连接效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端 连接要高些。 ;(3)定向连接:;(4)同聚物加尾连接:;(5)人工接头连接:; 4、重组DNA导入受菌体 ; 5、重组体的筛选与鉴定; (一)根据遗传表型进行筛选的方法 (1)抗生素抗性筛选 (2)β-半乳糖苷酶系统筛选 (二)根据重组子结构特征进行筛选的方法;(1)抗生素抗性筛选: 大多数载体均带有抗生素抗性基因;(插入失活法) 抗生素抗性筛选;(2) β-半乳糖苷酶系统筛选;;原位杂交;6、外源基因的表达与分离纯化;(二)真核表达体系(酵母、昆虫、哺乳类动物细胞) 利用真核细胞作为受体细胞,诱导表达外源基因;(1)分离:提取和获得目的基因和载体 (2)切割:分别对目的基因和载体DNA 酶切; (3)连接:目的基因与载体连接,形成 新的重组 DNA分子; (4)转化:用重组DNA分子转化受体细 胞; (5)筛选:筛选转化成功的细胞克隆 (6)表达:培养获得外源基因的细胞或 生物体,获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。;第六节 重组DNA技术的在医学上的应用

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