生化实验_转氨酶(gpt)活性的测定报告.docx

实验二（2）转氨酶（GPT活性的测定 一． 研究背景及目的 转氨酶是生物体内重要的一类酶。转氨酶催化a -氨基酸的氨基与a -酮酸的 酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸， 这种作用被称为 转氨基作用 [1] 。转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余 a - 氨基酸 都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。其中以谷丙转氨酶（ GPT和谷草 转氨酶（GOT最为重要。GPT与 GOT舌性的测定在临床上有着重要应用，可作 为一些疾病诊断的指标。GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用， GOT崔 化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用， 草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转 变为丙酮酸与二氧化碳。 由于都有丙酮酸的生成， 所以可以通过实验测定一定时 间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。 本实验以动物的新鲜肝脏和血 清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。 二． 原理 由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高， 易于测得， 且动物或人的转氨酶 活性的测定应用广泛、 技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验 材料，对其中的一种重要转氨酶一一 GTP的活性进行测定。转氨酶活性测定的历 史沿革建立了金氏法、 穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法， 本实验采用的是金 氏法。该方法对转氨酶活力的定义是：血清在 37C, pH7.4条件下，与底物作用 60min后，每生成1卩M丙酮酸为一个转氨酶活性单位。丙酮酸含量的测定运用 的是比色法。丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱 性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色 便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。 三． 材料、试剂与仪器 材料： 新鲜家兔肝脏和血清 试剂[1] ： ① 磷酸盐缓冲液（ pH7.4） 甲液： 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液 乙液： 1/15 mol/L 磷酸氢二钾溶液 取甲液825ml，乙液175ml,混合，测得pH为7.4即可。 ② GTP 基质液 称取a -酮戊二酸29.2mg及DL-丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶中，加1mol/L的氢氧化钠溶液0.5ml , 校正pH至7.4，再以pH7.4的磷酸盐缓冲液定容。贮存于冰箱中备用，可保存 一周时间。 2,4- 硝基苯肼溶液 称取2,4二硝基苯肼20mg先溶于10ml浓盐酸中，再以蒸馏水稀释至100ml， 棕色试剂瓶内保存。 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠22mg溶解后转入100ml容量瓶中，用pH7.4的磷酸盐缓冲 液定容即可。 柠檬酸苯胺溶液 取柠檬酸 50g 溶于 50ml 蒸馏水中，再加苯胺充分混合即可，低温出现结晶时， 可置于37C水浴中溶解后应用。 0.4M 氢氧化钠溶液 仪器： DK-S2 4型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，编号 L304056） TPL-4OB氐温台式离心机（上海安亭科学仪器厂，编号 722光栅分光光度计（上海紧密科学仪器有限公司） 大龙系列加样器及吸头（20-200卩l，100-1000卩l，1000-5000卩） JP-100架盘药物天平（美国双杰兄弟有限公司，编号 3878） 配平天平（北京医用天平厂） 刻度试管，离心管，小烧杯，匀浆器，洗瓶，冰浴 四． 操作步骤 1 ． 取 健康家兔，处死。心脏采血，分装至离心管（生理盐水浸润） ， 4000 转氐 温离心15min,取上清液冰浴待用。取肝脏，生理盐水冲洗沥干，取1g匀浆， 用磷酸盐缓冲液定容至10ml，4000转低温离心15min,取上清液，冰浴，记 为肝脏研磨液1。取2ml肝脏研磨液1,用磷酸盐缓冲液定容至4ml，冰浴， 记为肝脏研磨液 2。 2．取 6 支试管，编号，按下表操作 [1] 管号 1 2 3 4 5 6 丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 GPT底 物 0.50 0.45 0. 40 0.35 0.30 0.25 磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 再取18支试管，分为三组，每组6支，分别用于测定血清、肝脏研磨液 1、 肝脏研磨液2的GPT舌性，6支试管中3支作为测定管，另外3支作为对照管。 按下表操作： 试剂（单位ml） 测定管 对照管 血清或肝脏匀浆液 0.1 0.1 37 T 水浴 5min GPT底 物 0.5 将完成以上操作的24支试管按下表操作: 37 C 水浴 30min 各管加入2,4-二硝基苯肼0.5ml 9支对照管中各加入GPT底物0.5ml 37 T 水浴 20min 各管加入 0