噬菌体展示技术操作步骤.docx

筛选多肽 试剂及配制 LB 培养基： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 5g 溶于去离子水，至 1L，高压灭菌， 4℃保存。 IPTG/Xgal ： 称取 1.25g IPTG ，1.0g Xgal ，溶于二甲基甲酰胺，至总体积 25ml ， -20℃避光保存。 LB/IPTG/Xgal 平板： 1L LB 培养基 +15g 琼脂粉，高压灭菌，冷却至 70℃以下，加入 1ml IPTG/Xgal ， 立即铺板， 4℃避光保存。 顶层琼脂糖凝胶： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 5g MgCl 2.6H 2O 1g 琼脂糖 7g 溶于适量去离子水中，至总体积为 1L 。高压灭菌，分装为 50ml/ 份，室温保存，使用时于微波炉内融化。 （5） 2× M9 盐： Na2HPO 4 12g KH 2PO4 6g NaCl 1g NH 4Cl 2g 溶于适量去离子水中，至终体积为 1L 。 小型平板： 500ml 2× M9 盐 500ml 3%琼脂粉 20ml 20%葡萄糖2ml 1M MgSO 4 0.1ml 1M CaCl 2 1ml 硫胺素（ 10mg/ml ） 在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至 70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于 4℃。 封闭缓冲液： 0.1M NaHCO3(PH 8.6) 5mg/ml BSA 0.02% NaN 3 过滤除菌，储存于 4℃。 TBS： 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 150mM NaCl 高压灭菌，室温储存。 PEG/NaCl ： 20%（ w/v ）聚乙二醇 -8000 2.5M NaCl 高压灭菌，室温储存。 碘化物缓冲液： 10mM Tris-HCl (PH 8.0) 1mM EDTA 4M NaI 室温避光保存。 操作步骤： 第一天 （ 1） 以 0.1M NaHCO3(PH 8.6) 制备 100 μg/ml 的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。 （ 2） 在每孔内加入 1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠） 。 （ 3） 在湿盒中， 4℃温和振荡孵育过夜。 4℃保存于湿盒中备用。 第二天 （ 4）将 ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至 10ml LB 培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将 ER2537 过夜培养物接种于含有 20ml LB 培养基的250ml 锥形瓶中（比例为 1：100）。37℃剧烈振摇。 （ 5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液， 4℃孵育至少 1h。 （ 6）去除包被液。用 TBST（ TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤 6 次。反复旋转确保孔底及 孔侧面都被洗涤。 按照步骤 5 的方法去除洗涤液 （也可利用自动洗板机洗涤） 。洗涤要迅速， 避免平皿干燥。 （注意每次更换纸巾，以避免交叉污染） 。 （ 7）用 1ml TBST 稀释 4×1010 噬菌体（ 10μ l 原库），加至包被后的平皿内，室温下轻 缓摇动 10-60min 。 （ 8）以步骤 5 的方法去除未结合的噬菌体。 （ 9）以步骤 6 的方法用 TBST洗涤板子 10 次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。 （ 10）用 1ml 的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（ 0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白 （ 100μ g/ml ）的 TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。 室温下轻缓摇动 10-60min 。将洗脱液转入微量离心管中。 （ 10a）或使用通用缓冲液， 0.2M 甘氨酸 - 盐酸（ PH2.2）， 1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过 10min ，将洗脱液转入微量离心管中，以 150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1) 中和。 （ 11）取小量洗脱液（ 1μ l ）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作） 。（未用的洗脱物可 4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情 况下，用 LB 过夜培养 ER2537，第二天，用 LB 培养基以 1：100 将该培养物稀释至 20ml ，加入未扩增的洗脱液，在 250ml 的锥形瓶内， 37℃剧烈振摇孵育 4.5h ，进入步骤 13）。 （ 12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入 20ml ER2537 培养物中（对数早期） ， 37℃剧烈振摇孵育 4.5h 。 （ 13）将培养物转入微量离心管中， 4℃，10000 转离心 10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。 （ 14）将 80%的上清转入新的离心管中，加入 1/6 体积的