电荷差异离子交换法教学PPT课件.ppt

Mono bead ■ 各种离子交换剂： Strong Weak Weak Strong Resin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Anion Exchanger Cation Exchanger IRC-150 Dowex-50 Dowex-1 Dowex-2 Dowex-3 IR-45 -NHR 2 + - -SO 3 -NR 3 + -COO - X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or cellulose CM-X DEAE-X TEAE-X (QAE-X) Phospho-X 阴阳强弱分类 S Q -OCH CH NHR 2 2 2 + -NR 3 + 4 2- -PO 2 - -OCH COO ■ 选 择 离 子 交 换 剂 + Net Charge of a Protein Buffer pH pI - 3 4 5 6 7 8 9 10 0 阴离子交換 阴离子子交換 ■ 质子可以吸附或脱离一基团： Proton： 最小且最多的生物粒子，影响酸碱度及分子帶電性质 H+ lone pair electrons H H H+ N H H N 胺 基 H+ 羧 基 C O O H C O O 类型：强酸、强碱、弱酸、弱碱等 H3+N-R-COOH H2N-R-COOH H2N-R-COO-+H2O 阳离子形式 等电点（R大分子链） 阴离子形态 pH < pI < pH’ 若蛋白质在高于等电点的pH范围内稳定， 若蛋白质在低于等电点的pH范围内稳定， 若蛋白质在低于或高于等电点的pH范围内都稳定，则既可用阳离子交换剂也可用阴离子交换剂，此时取决于工作液的pH值及杂质的带电情况。 带正电荷，则与阳离子交换剂进行交换反应； 带负电荷，则与阴离子交换剂进行交换反应； ■ 离子取代优先顺序 Pecking Order： ++ + + + + + + + + + + + + + + + + > > 电荷高者 离子大者 浓度大者 > ■ 阴 离 子 交 換 法 的 分 离 范 围 ： 100 50 25 7 5 6 4 kD pH Juang RH (2004) ECX 操作方式：间歇式分批操作：batch又叫静态处理，将离子交换剂泡于工作液中，达到平衡后，滤出介质进行洗脱。柱式操作：又称动态法，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行。 ■ 树脂的组成与外型： Cellulose Sephcel Monobead Pharmacia (1980) Separation News: 5 ● 树脂外型影响流速和分离度 Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24 ■ 不同树脂的吸附容量有很大差异： DEAE-Sephadex A-25 DEAE-Sephadex A-50 DEAE-Sepharose CL-6B DEAE-Sephacel Lactalbumin Albumin Ferritin 191 10 45 38 31 102 115 86 2 1 4.3 8.6 Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0 mg / mL gel Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64 Spin- down Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.70 ■离子交換法预备试验： 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 pH NaCl pH = 7 0.15 M NaCl mg/mL protein 50 Enzyme + Buffer + Gel Sup Incubation Spin Sup + Spindown 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 7.0 0.15 Capacity ■ 柱的装填方法： 缓 冲 液 平 衡 溫 度 平 衡 静 置 树 脂 清 洗 树 脂 预 估