酶联免疫吸附试验(elisa)基本原理与结果解释.pdf

精品文档 酶联免疫吸附试验（ ELISA ） 基本原理与结果解释 基本原理： 一、包被 1、固相载体的要求 （1）、结合抗体或抗原的容量大 （2 ）、抗体或抗原牢固地固定在其表面 （3 ）、不影响免疫反应性 （4 ）、利于反应充分进行 （5 ）、固相方法简便易行，快速经济 2、固相载体的材料：聚笨乙烯 3、包被 coating 将抗原或抗体结合于固相载体。 4、封闭 blocking 用 1%～5% 的牛血清白蛋白或 5% ～20% 小牛血清消除固相载体表面未结合的位点， 消除 非特异性吸附。 二、反应 加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。 标记酶的要求： (1) 、活性高 (2) 、性质稳定 (3) 、专一性强 (4) 、酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 、方法敏感，重复性好，简单易行 (6) 、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 常用酶 辣根过氧化物酶 HRP （ELISA 中应用最为广泛的标记用酶） 三、洗涤 . 精品文档 使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。 四、底物显色 HRP DH2+H2O2 —————→ D+2H2O H2O2 为受氢体， HRP 对受氢体的专一性很高。供氢体 DH2 习惯上被称为底物，底物有多 种。 常用底物：四甲基联苯胺 TMB 四甲基联苯胺 TMB 是 ELISA 中应用最广泛的底物。 TMB 反应后显蓝色 ，加酸终止反应后 变为黄色 ,测定波长 450nm ，稳定，无致癌性。 常用方法与原理 一、双抗体夹心法 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG 等 二、双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似双抗体夹心法 应用：乙型肝炎表面抗体 . 精品文档 三、竞争法（测抗原） 方法： 用已知抗体包被， 加入待测血清， 再加酶标抗原， 酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。 加底物显色。 应用： 用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 四、竞争法（测抗体） 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体 (HBcAb) 和乙型肝炎病毒 e 抗体 (HBeAb) 的检测 五、间接法 方法： 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人 IgG （抗抗体或二抗）加底物显色。 优点： 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 应用： 常用于 HCV 抗体、 HIV 抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。 . 精品文档 六、捕获法 方法： 抗人 IgM μ链抗体包被捕获待测标本中 IgM 类抗体→加入特异性抗原和酶标记特异性 抗原的抗体底物→显色 应用： 病原体急性感染诊断中的 IgM 型抗体、 甲型肝炎 HAV-IgM 抗体 、 . 精品文档 乙型肝炎病毒核心 HBc-IgM 抗体