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circRNA qPCR 引物设计的方法
1、通过 cirbase 数据库(/)获得 circRNA 的序列,如hsa_circ_0014629:
进入如下页面
点击 fasta,获取序列,如下:选择 spliced
>hsa_circ_0014629|NM_001037533|GON4L
CCTCCTCAGTTTGTGGATATCCACCTTGAAGAAGATGATTCCTCAGATGAAGAATACCAGCCGGATGATGAAGAAGAAGA TGAAACTGCTGAAGAGAGCTTATTGGAAAGTGATGTTGAAAGCACTGCTTCATCTCCACGTGGGGCAAAGAAATCCAGAT TGAGGCAGTCTTCTGAGATGACTGAAACAGATGAGGAGAGTGGCATATTATCAGAGGCTGAGAAAGTCACCACACCAGCC ATCAGGCACATCAGTGCTGAGGTAGTGCCCATGGGGCCCCCGCCCCCTCCAAAGCCGAAACAGACCAGAGATAGTACTTT CATGGAGAAGTTACATGCGGTAGATGAGGAGCTGGCTTCCAGTCCAGTCTGCATGGATTCTTTCCAGCCCATGGATGACA GTCTCATTGCATTTCGAACGCGTTCTAAGATGCCCCTGAAAGATGTTCCCCTGGGCCAATTAGAGGCAGAGCTCCAAGCT TTGATGGGAGCTATGCAGCTGATTGAAGACTTCAGCACACATGTCAGCATTGACTGCAGCCCTCATAAAACTGTCAAGAA GACTGCGAATGAATTTCCCTGTTTGCCAAAGCAAGTGGCTTGGATTCTGGCCACAAGCAAGGTTTTCATGTATCCAGAGT TACTTCCAGTGTGTTCCCTGAAGGCAAAGAATCCCCAGGATAAGATCGTCTTCACCAAGGCTGAGGACAA
2、取首尾各 150bp 进行拼接,末尾 150bp 作为拼接后的首序列,如下:
GACTGCGAATGAATTTCCCTGTTTGCCAAAGCAAGTGGCTTGGATTCTGGCCACAAGCAAGGTTTTCA TGTATCCAGAGTTACTTCCAGTGTGTTCCCTGAAGGCAAAGAATCCCCAGGATAAGATCGTCTTCACC AAGGCTGAGGACAACCTCCTCAGTTTGTGGATATCCACCTTGAAGAAGATGATTCCTCAGATGAAGAA TACCAGCCGGATGATGAAGAAGAAGATGAAACTGCTGAAGAGAGCTTATTGGAAAGTGATGTTGAAAG CACTGCTTCATCTCCACGTGGGGCAAAG
3、将该部分 300bp 用 primer-blast 进行引物设计,具体参数如下:
/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHo
me
4、选择引物对。注:PCR 产物包含 back-splicing 位点
Sequence (5'->3')
Template strand
Length
Start
Stop
Tm
Forward primer
ATTCTGGCCACAAGCAAGGT
Plus
20
44
63
60.18
Reverse primer
CACAAACTGAGGAGGTTGTCCT
Minus
22
165
144
60.16
Product length
122
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