铜绿假单胞菌PAO1中基因PA4427-31的功能探究.pdf

铜绿假单胞菌PAO 1 中基因PA4427-31 的功能探究 摘要 铜绿假单胞菌是常见的革兰氏阴性机会致病菌，在囊性纤维化（CF ）患者 和免疫功能低下的个体中容易引起较高的发病率和死亡率。然而，由于铜绿假单 胞菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和β- 内酰胺类等多种抗生素具有耐药性，同时感染 铜绿假单胞菌后容易引起多种细菌的交叉感染，所以给临床上治疗铜绿假单胞菌 引起的感染增添了许多的困难。 PA4427-28 和PA4429-31 处于同一操纵子。课题组前期证明了PA4429-31 可 能编码细胞色素bc1 ，其缺失影响氨基糖苷类抗生素抗性和毒力因子的产生，具 体机制还需要进一步探索。另外，前期在构建互补菌株的过程中我们发现只有在 互补整个操纵子时 ΔPA4429-31 的氨基糖苷类抗生素抗性恢复至野生型。因此， 本实验进一步探索了基因PA4429-31 和 PA4427-28 的功能。 本研究通过有氧呼吸链、厌氧呼吸链的完整性检测以及细菌自溶检测了 PA4429-31 与呼吸链之间的联系。并且，我们通过动植物感染模型检测了 PA4429-31 对细菌的致病性的影响。进一步进行了RNA-Seq 探究PA4429-31 作 用的机理。此外，基于分子生物学手段对PA4427 和PA4428 进行了生长、耐药 性的相关研究。 首先，我们首次用实验证明了PA4429-31 编码细胞色素bc1 ，影响细菌的致 病性。通过转录组测序发现PA4429-31 突变影响细菌铁转运过程中的相关基因的 表达，通过外源添加不同运输状况下的相应铁源，发现PA4429-31 功能的缺失导 致铜绿假单胞菌不能利用环境中的FeCl ，而可以利用FeSO 和柠檬酸铁，同时 3 4 也影响了绿脓菌素的产生、生物被膜的形成以及 H O 的敏感性。而对 PA4427 2 2 和 PA4428 功能研究发现，单独突变这两个基因与抗生素的抗性、碳、氮、铁、 镁和磷酸盐等营养饥饿、pH 极端环境无关。PA4427 与大肠杆菌sspB 相似，可 以正向调节蛋白水解酶ClpX 。而PA4428 通过不依赖于胞外多糖的作用正向调节 生物被膜的产量。 本研究为药物开发提供一个新的思路，并且为铜绿假单胞菌的饥饿蛋白的研 I 究提供一定的理论基础。 关键词：铜绿假单胞菌，铁吸收，呼吸链，致病性，饥饿蛋白 II 插图索引 图1 铜绿假单胞菌的多分支呼吸链3 图2 亚铁运输系统7 图3 铜绿假单胞菌QS 系统9 [105] 图4 结合的SsrA 标签的SspB 亚基 11 图5 基因PA4429-31 影响呼吸链的完整性23 图6 基因PA4429-31 参与厌氧呼吸链的组成24 图7 基因PA4429-31 影响细胞自溶25 图8 ΔPA4429-31 的致病性检测26 图9 PAO1 和ΔPA4429-31 组间差异基因火山图26 图10 氧化磷酸化途径KEGG 分析27 图11 外源添加铁离子ΔPA4429-31 对生长的影响30 图12 外源添加铁离子ΔPA4429-31 对绿脓菌素的影响32 图13 外源添加铁离子ΔPA4429-31 对生物被膜的影响34 图14 外源添加铁离子ΔPA4429-31 对H O 敏感性的影响36 2