OGA在炎症相关性结直肠癌演变过程中的作用研究.pdf

摘要 背景及目的： 结直肠癌(CRC) 是全球最常见的恶性肿瘤，结肠炎(colitis) 或炎性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD)作为一种反复发作的慢性炎症,是 CRC 的高危因素 之一。炎症相关性结直肠癌(colitis-associated cancer,CAC)是典型的炎症相关的结肠 肿瘤，除了传统的手术、放疗、化疗及免疫治疗，中医药治疗在其中也发挥了不可替 代的作用，但因其研究方法的局限性，有价值的临床数据较为缺乏，使其难以被广泛 接受和认可。合适的动物模型能最大化的指导肿瘤临床治疗，用于药物敏感性测试， 寻找作用靶点，从而进行精准化治疗。近年来研究表明，异常的O-GlcNAc 糖基化修 饰在 CAC 进展中的地位越来越受到重视，目前关于 O-GlcNAc 水解酶OGA 在结直 肠癌疾病进展中研究较少，且在CAC 中的作用尚不清楚，本课题拟构建OGA 肠上 皮特异敲除(OGA-IKO)小鼠模型，在该模型基础上诱导CAC ，讨论OGA 敲除对CAC 发生发展的影响，对评价中药抗肿瘤疗效机理提供更可靠的基础研究。 研究方法： 1. 根据Cre/Loxp 系统原理，构建OGA-IKO 小鼠模型。 2. 在 OGA-IKO 小鼠模型基础上使用氧化偶氮甲烷（AOM ）与葡聚糖硫酸钠 （DSS ）诱导CAC 。观察表型并通过Western Blot 、qRT-PCR 等方法对小鼠炎症和肿 瘤相关指标进行检测。 3. 采用 16S rDNA 高通量测序技术对炎症相关性结直肠癌小鼠进行肠道细菌种 类和丰度检测，分析肠上皮特异敲除OGA 对小鼠肠道菌群的影响。 4. 采用 IHC 与 qRT-PCR 方法检测 OGA 、OGT 、O-GlcNAc 在人结肠癌组织与 癌前病变组织中的表达情况，分析其与结直肠癌发生和发展的关系。 5. 选取人 CRC 细胞系HCT- 116 和RKO ，利用慢病毒感染方法，构建OGA 敲 减细胞系。采用qRT-PCR 和Western blot 等实验方法验证OGA 的敲减效率，并利用 CCK8 法、平板克隆、细胞划痕及 Transwell 等方法检测 OGA 敲减对结肠癌细胞增 殖与转移功能的影响。 结果: I 1. 成功构建OGA-IKO 小鼠模型。 2.小鼠结直肠癌诱导实验结果表明，与野生型(Wild Type, WT)小鼠相比，OGA 肠 上皮特异敲除组（Intestinal Knockout, IKO ）小鼠的成瘤率明显下降（IKO 组 77.8 % vs WT 组 100 % ，P0.05 ）；存活率显著升高（IKO 组92 % vs WT 组66 % ， P0.0 5 ）；肠上皮组织破坏程度较轻，炎症因子IL-6 、IL- 10 表达降低，TNF-α 表达 没有显著性差异，提示肠上皮特异敲除OGA 减少了炎症相关性结直肠癌的发生。 3. 16S rDNA 测序发现，CAC 诱导后，OGA 肠上皮特异敲除小鼠的菌群多样性 增加，菌群的构成也发生了明显改变。与野生型小鼠相对比，IKO+AOM+DSS 组小 鼠中Bifidobacteriale (双歧杆菌属)及Saccharibacteria （糖化菌属-TM7)抗炎菌相对丰 度显著增加，Enterococcus （肠球菌属）、Pasteurellales （巴斯德氏菌属）、Lactococcus （乳酸乳球菌属）等促炎相关菌丰度降低，可能与OGA 肠上皮特异敲除后肠道炎症 反应减轻有关。 4. 相比于癌旁组织，OGA 、OGT 、O-GlcNAc 在人结肠癌组织中表达升高；在结 肠癌癌前病变组织中的表达结果显示，OGA 在正常肠上皮、低级别上皮内瘤变（L ）、 高级别上皮内瘤变、结直肠癌组织中的阳性表达率分别为 38.5 % （5/13 ）、 54.55 % (6/ 11)、90 % （9/10 ）、92.8 % （13/14）; OGT 在正常肠上皮、低级别上皮内 瘤变、高级别上皮内瘤变、结直肠癌组织中的阳性表达率分别为 30.70 % （4/13