发酵工程制药ppt演示课件.ppt

（三） 提高抗生素的产量 2、增加参与生物合成中的限速阶段基因的拷贝数 反馈抑制(feedback inhibition)是生物合成限速反应的实质，一般是终产物对合成反应某个环节发挥作用的酶活力的抑制，这个环节就是“限速瓶颈”，被抑制的酶就是“限速酶”。 增加酶基因的拷贝数以提高限速酶的的浓度是增产的基本措施； 天蓝链霉菌十一烷基灵红菌素的生物合成最后一步的0-甲基转移酶、泰乐星生物合成的最后一步的0-甲基转移酶，增加这个酶基因的拷贝数可以提高终产物的产量。 异青霉素合成酶(Isopenicillin N Synthetase, IPNS)的基因与酰基转移酶基因紧密连锁，可能是青霉菌(Penicillium sp.)青霉素生物合成的限速酶； 青霉素N做为头孢菌素C的中间产物，它的积累使头孢菌素C产量下降。说明扩环酶基因cefEF属于限速酶 ； （三） 提高抗生素的产量 3、发挥调节基因的作用 抗生素生物合成基因簇中存在调节基因，以精细调节整个基因簇成员的表达强度； 增加正调控基因拷贝数可以增加抗生素的产量； 降低负调控基因的活性也可以提高抗生素的产量； 天蓝色链霉菌(S. colicolor)的放线紫红素(actinorhodin)生物合成基因簇成员act Ⅱ的四个ORFs都是调控基因，对act Ⅰ、act Ⅲ和其它基因起正调控作用；增加act Ⅱ的剂量可以使放线紫红素产量提高20-40%。 act Ⅱ(编码聚酮合成酶 ketosynthase, KS和链长决定子 chain length determining, CLF) ；act Ⅲ (编码酮基还原酶 ketoreductase, KR) 第九节  基因工程在发酵工程中的应用 以天然产物为基础发展药物的方法 获得新型结构和生物活 性的抗生素变得越来越难 一. 自然分离 合成步骤繁多、合成产率低下 二. 化学合成 以微生物作为“细胞工厂”，通过对代谢途径的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。 基因工程改造传统制药工业体现在四个方面 1、抗生素生产：分离抗生素合成酶基因，提高产量、得到杂合抗生素； 2、氨基酸生产：基因克隆的工程菌、细胞融合育种； 3、维生素生产：构建制造维生素C的基因工程菌； 4、疫苗生产：把抗原克隆到 E. coli中大量生产疫苗。 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。 菌种选育 突变、体内重组、 体外重组（基因工程） 一、基因工程在抗生素生产中的应用 往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产 微生物基因工程育种 这是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。 获得特定的目标基因 载体 (质粒或病毒) 目标基因片段 质粒DNA片段 内切酶切割 细胞外重组 重组DNA 重组DNA进入受体细胞并扩增、表达 具有目标基因表达功能的重组体 利用遗传标记筛选 转化(质粒)、转导或转染(病毒) （一） 抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法 1、抗生素生物合成基因群成员的结构特点 在已知的微生物所产生的抗生素中，约2／3由放线菌产生，而其中的80％来源于链霉菌；链霉菌属中的链霉菌，有约500个种。 2002年5月，Bentley S.D.等在英国 Nature 报道了链霉菌的模式种天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) A3 (2)菌株的基因组全序列研究结果：基因组全序 8,667,507 bp，GC含量72.12%，7825个基因，55个假基因，基因平均长度991 bp，编码密度88.9%。 ⑴ 链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成 GC含量高达70％以上； 三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高。 ⑵ 抗生素生物合成基因成簇存在： 参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个;阿克拉霉素 每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后排列成基因簇(gene cluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。 抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。研究还发现，产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的抗菌素产量水平呈正相关。 阿克拉霉素Aclacinomycin 目前用于治疗急性白血病(Leukemia)与淋巴瘤(Lymphomas)有良好疗效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomyces galilaeus 合成的聚酮类化合物，其合成酶的生物合成涉及13个基因，紧密成簇排列。返回 ⑶ 少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质