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基因工程 ：通过载体将目的基因转入靶细胞以改变靶生物的遗传性状的技术。 基因工程技术的基本环节 ：①目的基因克隆②载体的准备③目的基因与载体的连接④重组 DNA导入受体 细胞⑤重组体的筛选与鉴定⑥重组体的大量培养表达 基因工程从哪几方面来影响生物性状 ：①强化基因的表达， 改善生物性状②关闭特定基因的表达， 改善 生物性状③导入外源基因，表达新性状 RE ：特异性识别短的双链 DNA序列并切割靶位点或别处的酶。 同尾酶 ：一类来源不同，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同粘性末端的酶。 酶的星号活性 ：RE 识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位 点会改变，导致识别与切割位点的非特异性，这种现象称为 ~ DNA 连接酶 ：在双链 DNA的单链缺口之间，使相邻的 3 ’-OH 和 5’-P 末端形成磷酸二酯键的酶。 DNA聚合酶 ：在有引物的情况下 DNA模板的指导下合成子代 DNA的酶。 简述Ⅱ型 RE 的基本特点 ：1)识别序列的特异性： 识别序列长度为 4~6bp 具有双重旋转对称结构的回文 序列 2）切割位点的特异性①酶切片段的末端可以是粘性末端和平末端②同裂酶③同尾酶 影响 RE 活性的因素 ：①酶的纯度② DNA样品的纯度③ DNA的甲基化程度④酶切反应的温度⑤ DNA分子 的构型⑥反应缓冲液⑦酶的星号活性 载体： 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具称为载体。 克隆载体 (cloning vector)为使插入的外源 DNA序列能被克隆、 扩增和保存而特意设计的载体称为克隆载 体 理想载体必须具备的条件： ①具有对受体细胞的可转移性②具有复制起点， 能稳定自主复制③具有若干 限制酶单一识别位点 ,MCS④具有易检测的遗传标记 （抗菌素抗性） ⑤具有较小的分子量和较高的拷贝数 质粒载体： 存在于细菌细胞中独立于染色体 DNA而自主复制的双链闭合环状结构的 DNA分子。 质粒的不相容性： 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象称为质粒的不相容性 λ噬菌体的分类及用途： 插入型载体只能承受较小分子量 （一般在 10kb 以内） 的外源 DNA片段的插入， 广泛应用于 cDNA及小片段 DNA的克隆。替换型载体则可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，所以 适用于克隆高等真核生物的染色体 DNA。 表达载体 (expression vector) 指一类用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。除具 有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的元件。 原核表达载体表达元件： 除普通克隆载体具备条件外还具有： ①启动子②转录终止序列③核糖体结合位 点 DNA提取的基本原理： DNP和 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。 DNP在低浓度盐溶液中， 几乎不溶解，如在 0.14 mol/L 的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的 1%，随着盐浓度的增加溶解 度也增加，至 1mol/L 氯化钠中的溶解度很大，比纯水高 2 倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影 响较小，在 0.14mol/L 氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 DNA 及质粒的提取原理 :DNA :DNA 是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶液，生物细胞 中的大部分 DNA 集中在细胞核， 多以 DNP 形式存在， DNP 和 RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影 响而不同，用这个性质可以分离 DNP 和 RNP 这两种核蛋白。提取 DNA 时一般先破碎细胞释放 DNA ， 并对 DNA 进行保护，使其不受 DNA 酶的降解，再加入离子变性剂、去污剂时蛋白质和多糖类变性， 核蛋白解聚， 再根据