试验十一谷丙转氨酶活性的测定.ppt

实验十一 谷丙转氨酶活性的测定 实验原理 ? 丙转氨酶（ GPT ）能催化丙氨酸和 α - 酮戊二酸生成谷氨 酸和丙酮酸。丙酮酸在 酸性条件 下与 2 ， 4 －二硝基苯肼 可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕 红色， 在一定的浓度下 ，颜色的深浅符合比尔定律，在 520nm 处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可 计算出酶活性。 应 用 ? GPT 在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病 毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损， GPT 就释放到血液 中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定 血清谷丙转氨 酶的活性可作为诊断肝病的重要指标 。 实验方法 1. 标准曲线的制备 0 1 2 3 4 5 2mM 丙酮酸标准溶液 （ ml ） 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 磷酸缓冲液（ ml ） 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 GPT 底物溶液（ ml ） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 A. 取干净试管 6 支，编号后按照下表添加试剂。 B. 将试管置于 37 ℃ 水浴中保温 10min ，然后向每管中加入 0.5ml2,4- 二 硝基苯肼 ，再继续 保温 20min 。 C. 分别向各管中加入 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 5ml ，室温下静止 10min 。 D. 用“ 0” 号管作为空白对照，与 520nm 下测定吸收值。 E. 以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。 2.GPT 活性的测定：取干净试管 4 支，按照下表添加试剂。 试剂 测定 1 对照 1 测定 2 对照 2 鱼肌肉匀浆液（ ml ） 0.25 0.25 0.25 0.25 GPT 底物溶液（ ml ） 0.50 0.50 37 ℃ 水浴加热 30min （ 转氨基反应 ） 2,4- 二硝基苯肼（ ml ） 0.50 0.50 0.50 0.50 GPT 底物溶液（ ml ） 0.50 0.50 37 ℃ 水浴加热 20min （ 丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼反应 ） 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 （ ml ） 5.00 5.00 5.00 5.00 各管反应完成后混匀，室温静止 10min 后，以对照管 1 或者对照 2 调 节零点，测定 1 和 2 号管的吸收值。 实验数据计算 ? 由标准曲线查出 1 号和 2 号反应管中的丙酮酸的量，根据下 面的公式计算 GPT 的活性。 ? GPT 活力单位的定义 ：单位时间（每小时）内，单位体积 （每 ml ）的酶反应生成的产物的量（ mM ）。 GPT 活力（单位） = 反应管中丙酮酸的量（ mM ） /0.5 小时× 0.25ml 实验注意事项 1 、在呈色反应中， 2,4- 二硝基苯肼与含有酮基的化合物反 应形成苯腙。底物中的α - 酮戊二酸可以与 2,4- 二硝基苯 肼反应，生成α - 酮戊二酸苯腙。因此在制备标准曲线的 时候需要加入一定量的底物以抵消α - 酮戊二酸的影响。 2 、严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。