试验十乳酸脱氢活性的检测.ppt

实验十 乳酸脱氢酶活力测定 目 的 要 求 1 、了解乳酸脱氢酶活性测定原理。 2 、学习用比色法测定酶活性的方法。 实 验 原 理 ? 乳酸脱氢酶（ lactate dehydrogenase 简称 LDH ）广泛存在 于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化 下列可逆反应。 ? LDH 可溶于水或稀盐溶液。组织中 LDH 含量测定方法很多， 其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于 NADH, NAD + 在 340nm 及 260nm 处有各自的最大吸收峰 ，因此以 NAD+ 为辅酶的各种脱氢酶类都可通过 340nm 光吸收值的改变 ， 定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、 甘油－ 3 － 3 磷酸脱氢酶等。 ? 本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向 含丙酮酸及 NADH 的溶液中，加入一定量乳酸脱 氢酶提取液，观察反应过程中 340 nm 处光吸收减 少值，减少越多，则 LDH 活力越高。 ? 其 活力单位定义 是：在 25 ℃ ， pH7.5 条件下每分 钟 A 340 下降值为 1.0 的酶量为 1 个单位。 LDH 活力测定 1. 预先将丙酮酸钠溶液及 NADH 溶液放在 25 ℃ 水浴中 预热 。 2. 取 2 只石英比色杯，在 1 只比色杯中加入 0.1mol/L pH 7.5 磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液 3 ml ，置于紫外分光光度 计中，在 340 nm 处将光吸收 调节至零。 3. 另一只比色杯用于 测定 LDH 活力，依次加入预热的丙酮酸 钠溶液 2.9 ml ， NADH 溶液 0.1 ml ， 用移液枪反复吹打若 干次混匀 ，测定 340 nm 光吸收值（ A ）。加入经稀释的酶 液 10 μ l ， 立即计时 ，混匀后，然后每隔 0.5 min 测 A340 ， 连续测定 3 min ，以吸收值 A 为纵坐标，反应时间为横坐 标作图，取反应最初线性部分，计算每分钟 A340 减少值。 数据处理 ? 计算每毫升组织提取液中 LDH 活力单位： LDH 活力单位（ U ） /mL 提取液 ＝ 注：稀释倍数为 5 倍 注意事项 1 、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，贮存在 -20 ℃ 。 2 、酶液的稀释度及加入量应控制每分钟 A340 下降值在 0.1- 0.2 之间，以减少实验误差。 3 、 NADH 溶液应在临用前配制。 思考题 1 ．简述用紫外分光光度法测定以 NAD + 为辅酶的各种 脱氢酶测定原理。