聚合酶链式反应pcr.ppt

一、 PCR 的定义： PCR （ polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外 DNA 扩增 技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA 片段的技术。 DNA 扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到 DNA 酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但 操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及 。 PCR 技术： 1985 年由美国 Cetus 公司的 Kary Mullis 首创，可以将微量目的 DNA 片段扩增一百 万倍以上。 优点： 敏感度高、特异性强、产率高、重复性 好以及快速简便 等，广泛应用于微生物学、考古学、 法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室， 大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地 对目的基因进行分析、鉴定。 Kary Mullis 本人因此获 1993 年诺贝尔化学奖。 二、 PCR 的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA 片段， 类似于天然 DNA 的复制过程。 以拟扩增的 DNA 分子为模板，以一对分别与模 板 5 ′ 末端和 3 ′ 末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿 着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过 程，即可使目的 DNA 片段得到扩增。 扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的特异 结合 ，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation) ： 加热使模板 DNA 双链间的氢键断裂而形成两 条单链。 94 ℃ 30″ 2. 退火 ( 复性 ) (Annealling): 突然降温后模板 DNA 与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。 55 ℃ 30 ″ 3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到 酶的最适温度 ，在 DNA 聚合 酶、 4 种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的 新 DNA 链。 72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的 DNA 量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过 25 ～ 40 个循环后 DNA 可扩增 10 6 ～ 10 9 倍。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72 ? C 退火 Tm- 5?C 5 ? Primer 1 5 ? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? Template DNA 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 目 录 PC R 技术原理 Cycle 3 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 5 ? 25 ～ 30 次循环后，模板 DNA 的含量 可以扩大 100 万倍以上。 目 录 PCR 扩增的特异性 是由一对寡核苷酸引物所 决定的 。反应初期，原来的 DNA 担负起使模板的 作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的 片段急剧增多而成为主要模板， 最终的扩增产物 是介于两种引物 5 ' 端之间的 DNA 片段 。 三、 PCR 的成分和作用： 终浓度 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火， >50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作