聚合酶链式反应polymerasechainreaction.ppt

s Southern 印迹杂交 DGGE 是一种筛选单碱基突变及多态 性的方法。 DGGE 检测突变的原理是基于 给定 DNA 双链的解链温度因存在突变而发 生改变加以测定。 DGGE 的突变检出率可 达 90% ～ 100% 。 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) DGGE 检测 DNA 突变 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction 上海第二医科大学 检验系 樊绮诗 PCR 技术 ? 由美国 Cetus 公司 K.Mullis 于 1983 年建立 ? 能在体外复制已知序列的 DNA 片段 ? 具有扩增效率高和特异性强的特点 ? 为生命科学领域的研究开创了崭新时代 延伸 5' 3' 5' 3' 继续延伸 5' 3' 5' 3' Taq Taq 3' 5' 3' Taq Taq 循环 PCR 原理 5' 3' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 第二个循环 4 个拷贝 第三个循环 8 个拷贝 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 第 n 个循环 2 n 个拷贝 PCR 原理 PCR 的反应体系 参与 PCR 反应的主要成份 : 模板、引物、 dNTP 、 Taq DNA 聚合酶和 缓冲液等。 PCR 的反应条件 ? 反应温度（变性、退火、延伸） ? 反应时间（变性、退火、延伸） ? 循环次数（ PCR 效率及产物量） 变性温度和时间 模板 DNA 充分变性是 PCR 顺利进行的前 提。在 PCR 扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组 DNA 充分变 性。一般在 94 0 C 变性 5 ～ 10 min 。进入循环反 应后以 94 ℃变性 30 ～ 40s, 足以使模板 DNA 双 链变性。 退火温度和时间 PCR 反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm5 0 C 左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。 延伸温度与时间 延伸温度设为 72 ℃， 因为 Taq DNA 聚合 酶在 72 ℃时具较高的酶促活性，有利于 DNA 的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过 长易导致非特异性扩增。 模 板 (template) ? 模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因组 DNA 和 RNA 、质粒 DNA 和线粒体 DNA 等） ? 模板 DNA 须有较高的纯度 ? 模板加入量影响 PCR 效率和产物的特异性 引 物（ Primers) ? 化学合成的寡核苷酸 ? 能与模板特异地结合 ? 引物决定产物的特异性和长度 ? 引物设计时必须遵循一些原则 引物设计基本原则 ? PCR 反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补 ? 引物的长度一般以 18~25 个核苷酸为宜 ? 二条引物之间（尤其在 3' 端）的序列不 可有互补，以免形成引物二聚体 ? 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、 嘧啶碱基堆积 引物设计基本原则 ? 引物的 3 ' 端尤其要避免重复的 CG 碱基序列 ? 二条引物的 Tm 值不能差别太大 ℃ Tm =2 （ A+T ） +4 （ C+G ） ? 合成引物时在其 5 ' 端可以加修饰成份 ? 设计引物最好用电脑软件进行分析 脱氧核苷三磷酸（ dNTP ） ? 是 dATP 、 dCTP 、 dGTP 和 dTTP4 种脱氧 核苷三磷酸的混合物 ? 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 ? 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 DNA 聚合酶 ? 从一种生活在热泉（ 80 ℃ ~90 ℃）中