Illumina平台测序原理及常见测序文库构建详细版.pptx

Illumina 平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介.精品课件.目录.精品课件.第一部分：测序测序原理与流程 简介.精品课件.文库构建(~ 6 hrs)DNAcBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeq1-8 samplesHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace.精品课件.Illumina 测序流程文库构建(~ 6 hrs)DNAcBotHiSeq25001-8 samples MiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8 samples GA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace.精品课件.文库构建流程片段化 DNA末端补平3’加A接头连接PCR.精品课件.高质量DNA文库结构Index Sequencing Primer此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头.精品课件.文库构建(~ 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000HiSeq25001-8 samples GA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace.精品课件.测序芯片 (Flow Cell)简介在flow cell上进行cluster簇生成flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头).精品课件.仪器简介约1000条DNA模板的 拷贝35个循环的桥式PCR单条DNA 模板cBotHiSeq Sequenncceerr.精品课件.cBot 工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物，合成第一链桥式PCR：冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR线性化：将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除阻断3’–OH：防止在后续测序过程中继续延伸DNA链杂交测序引物.精品课件.DNA模板杂交和一链合成接头序列单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面5’-3’ 延伸.精品课件.双链DNA变性新合成的链原始模板链模板链被冲洗走丢弃原始模板链新合成的链留在FlowCell 上.精品课件.桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥”以接头为引物进行扩增.精品课件.桥式PCR扩增.精品课件.变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子.精品课件.第二轮桥式PCR扩增.精品课件.完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR.精品课件.线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的 切割位点.精品课件.线性化切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链.精品课件.阻断阻断3’ –OH.精品课件.杂交Read 1 引物Read1 测序引 物将测序引物杂交到文库的接头上.精品课件.Illumina 测序流程文库构建(~ 6 hrs)cBot HiSeq25001-8 samples MiSeqHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeq1-8 samplesHCS/RTAICS MSRCASAVABaseSpace.精品课件.HiSeq SBS 测序流程进行Read1 测序杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序.精品课件.HiSeq SBS 测序流程31Paired End Turnaround2.精品课件.Sequencing By Synthesis，SBS测序原理去阻断，切除荧光基团4种 Fl-NTP’s +聚合酶拍照，收集信号X 36 - 151.精品课件.可逆终止化学反应一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子)准确度高可以得到同聚物序列下一个碱基合成合成照相，收集信号去阻断，切除荧 光基团.精品课件.Clusters100 Microns.精品课件.Paired End TurnroundBlocked 3’-ends已完成测序