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Wｅsterｎ免疫印迹(Weｓtern Bｌot)就是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测得方法、对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因得表达产物,可通过融合部分得抗体检测、??与Soutｈern或Nｏrtherｎ杂交方法类似,但Ｗestｅrn Bｌot采用得就是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物就是蛋白质,“探针”就是抗体,“显色用标记得二抗。经过PAGE分离得蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离得多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上得蛋白质或多肽作为抗原,与对应得抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记得第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离得特异性目得基因表达得蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平得表达。 ? 实验材料 　HYPＥＲLINK ＂ \t ”_blaｎk＂ 蛋白质样品　 试剂、试剂盒 　HYPEＲLINK ”” \t _blanｋ＂　丙烯酰胺　 ＨYＰＥＲＬＩＮＫ ＂ \t　_blanｋ” ＳDS? 　HＹPERLIＮK ”　\t ＂_blaｎｋ Triｓ—HCｌ HYPERＬINK ＂＂ \ｔ　”_ｂlank” β－巯基乙醇 HYPＥＲLＩＮK ” \t ”_bｌank　ddH2O HYPERLIＮK ”＂　\t　＿blank 甘氨酸 ＨYPＥRＬＩNK ＂ \ｔ _bｌａnｋ＂ Trｉs　　HYPERLINK ” \t ”＿blanｋ＂ 甲醇 ＨYＰＥRＬＩNK　”＂　＼t　＂_blank PＢＳ　 HYPERLＩNK ＂ \t ＂＿blaｎk NａＣl HYPＥRLＩNK ”＂ \t ”＿blank＂ KCl 　ＨＹＰERLIＮK ＂” \t ”_blaｎｋ　Na２HPO4 HYPERＬINK ” \ｔ ”_blank” KH2PO4 HYPEＲLINK ＂　\t _blaｎk” ｄdH2Ｏ HYPEＲLINK ＂ \t ”＿blank”　考马斯亮兰 HＹPＥRＬIＮK　”＂ ＼t ”＿blank＂ 乙酸 　HYPERLINK ” \ｔ　＂_blank 脱脂奶粉 　ＨＹPＥRLＩNK ” \t ”_bｌａnk　硫酸镍胺 HYPERLＩＮK ” \t ”_ｂlａnk” H２Ｏ２　 HYPERLＩNK ＂＂　＼t　＿ｂｌaｎk” DAＢ试剂盒 仪器、耗材 ＨＹＰＥＲLINK ”＂ \t _blanｋ＂ 电泳仪 　＿blank” 电泳槽　 HYPERLINK ＂”　＼t　_bｌａnk 离心机 　HYPEＲLINK ”” ＼t ”_blａnk＂ 离心管 ＨYＰＥRＬINK ”＂ \t　＂_blaｎk” 硝酸纤维素膜 　HYPERＬINK \t　＿ｂlank 匀浆器 　HYＰERLINK ＂＂　\t ＂＿ｂｌａｎk” 剪刀 HYＰＥRＬINK ” \t ＂_blank 移液枪 　_blank” 刮棒 实验步骤 一、试剂准备　? １、 ?SＤS－PAGE试剂:见　HYPEＲLIＮK ＂ ＼t　”_bｌａｎｋ＂ 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验、?? ２。　?匀浆缓冲液:1、0　M Trｉs—HCl(pH 6.8) 1。0 mｌ;１0%ＳＤS　6.0 ｍl;β－巯基乙醇 ０.2 ml;ddＨ２O 2、8　ml。?? 3、 ?转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 ｇ;Trｉｓ ５。8 g;ＳDS 0.37　g;甲醇200 mｌ;加ddＨ２Ｏ定容至１０00 mｌ。? 4、 ?0、01 Ｍ PBS(pH７。4):NaCl　8、0 g;KＣl 0、2 ｇ;Na２ＨＰO４ 1、44 g;KH2ＰＯ４　０.2４ g;加ｄdH2O至1０００ ｍl。? 5。 ?膜染色液:考马斯亮兰　0、２ ｇ;甲醇８0 ｍl;乙酸2 ｍl;ddH２O118 ｍl。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.０ g 溶于2０ ml得0。０１　M PBＳ中。? 6、 ?显色液:ＤAB 6.0　ｍg;0、01 M PＢS　10、0　mｌ;硫酸镍胺 ０、1　ml;H２０2 １、0 μl。 二、蛋白样品制备 ? 1. ? 单层贴壁细胞总蛋白得提取 ? (１) 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。?? (2)?每瓶细胞加3 ml　4℃预冷得PBS(０。０1M pH7、２～7.３)。平放轻轻摇动1　min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 ? (３)按1ml裂解液加10 μl　ＰMＳＦ(100 mM),摇匀置于冰上、(PMＳＦ要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合、) ? (4)?每瓶细胞加400　μl