第一节核酸的分离纯化.ppt

第一节 核酸的分离纯化第二节 聚合酶链式反应（PCR） 第三节 凝胶电泳系统第四节 核酸的分子杂交第五节 核苷酸序列分析第六节 基因工程; 分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。;基因工程诞生的基础;三大成就 ：;2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；;Description of the 3-D structure of DNA;Conservative Model;3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。;但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。 ;两大技术保证：;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖;;1972 - Paul Berg;1973 - Boyer, Cohen Chang;;General process of gene engineering;5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。; ; 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）;第一节 核酸的分离纯化;主要内容; 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。;一、核酸分离、纯化原则;（二）防止核酸的生物降解;1 DNA酶抑制剂;2 RNA酶（RNAase)抑制剂; (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）剧毒。;（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC);二 分离提取核酸的主要步骤;（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。; 常用方法： 1 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； ; 3 酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。; 1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。;（三）核酸的沉淀;1 核酸沉淀的盐类及浓度;2 有机沉淀剂;（2）异丙醇;（3）聚乙二醇（PEG）;（4）精胺;3 核酸沉淀的温度和时间;(四）核酸的浓度测定;DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg /