临床免疫检验技术_第二单元_抗血清的制备_第十章_抗血清的制备.pptVIP

三、动物采血 1．颈动脉放血法：最常用的方法 2．心脏采血法：此法多用于豚鼠等小动物，技术要求高 3．静脉采血法：可多次进行，所以可收集到的血液量较多 四、抗血清的分离纯化及鉴定 采集的血液多采用在室温自然凝固，待凝块收缩后分离血清。前者迅速，但获得血清较少；后者时间长，但获得血清多，而且效价稳定。 （一）抗血清的分离 1.特异性抗体的纯化 ①亲和层析法 ②吸附剂方法 2.IgG类抗体的纯化 ①盐析 ②凝胶过滤 ③离子交换和亲和层析法 （二）抗血清的纯化 1.抗体效价的鉴定 一般原则是颗粒性抗原用凝集试验，可溶性抗原用双向琼脂扩散试验。 2.抗体特异性的鉴定 常用双向免疫扩散法进行鉴定。 （三）抗血清的鉴定 3.抗体纯度的鉴定 可采用免疫电泳、双向琼脂扩散试验、SDS等方法鉴定。 4.抗体亲和力的鉴定 常用ELISA、RIA和平衡透析法等进行测定。 1. 4℃保存：保存3～6个月 2. -20℃～-40℃保存：保存3～5年 3.冷冻真空干燥保存 ：长期保存 五、抗血清的保存 小 结 免疫原的制备主要包括细胞性免疫原、可溶性抗原和人工免疫原的制备。 抗血清的制备流程主要为：免疫动物的选择、免疫方案的制定、动物采血、抗血清的分离、纯化和鉴定和抗血清的保存。 第十章抗血清的制备 免疫原和佐剂的概念。 抗血清制备时免疫动物的选择和免疫方案的制定 。 抗血清制备的流程。 蛋白质的分离和纯化方法 。 佐剂的应用。 本章要点 目　录 免疫原的制备 1 免疫血清的制备 2 抗原和抗体是免疫学检测中的两大基本因素，抗原的纯化是制备特异性抗体的先决条件，制得的抗体又可用于抗原的纯化和检测。 前 言 第一节 免疫原的制备 免疫原（immunogen）就是抗原，是指能够刺激机体产生抗体并能与之发生特异性反应的物质。众多的抗原物质中绝少是单一组分的，所以必须从复杂的物质中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。 一、细胞性免疫原的制备 1.绵羊红细胞抗原制备 采集新鲜绵羊红细胞注入无菌并带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15分钟后除去纤维蛋白，再以无菌生理盐水洗涤3次，最后配成1×106/ml浓度的细胞悬液，即可应用。 2.细菌抗原的制备 细菌抗原有菌体抗原和鞭毛抗原等，多选用典型菌株的液体或固体培养物经集菌后处理。鞭毛抗原需用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理，而菌体抗原则需要在100℃加温2～2.5小时后应用。 蛋白质、酶、核酸、细菌毒素等皆为可溶性抗原，这些物质大多来源于人和动物的组织和细胞，要想获得此类抗原，通常要先破碎组织和细胞，再进一步提取和纯化。 二、可溶性抗原的制备及鉴定 1.组织匀浆的制备 高速捣碎法 研磨法 （一）组织和细胞中可溶性抗原的粗提 2.细胞破碎的方法 ⑴ 反复冻融法 ⑵ 超声破碎法 ⑶ 溶菌酶处理法 ⑷ 自溶法 ⑸ 表面活性剂处理法 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶过滤和离子交换层析 4.亲和层析 5.电泳 （二）可溶性抗原的提纯 纯化抗原的鉴定内容包括含量、分子量、纯度和免疫活性的鉴定等。鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、酶联免疫吸附试验、免疫电泳法、双向琼脂扩散试验等。 （三）纯化抗原的鉴定 用化学合成法或基因重组法制备的抗原，称之为人工抗原，包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。 三、人工免疫原制备 半抗原不能直接做为免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后，才具有免疫原性。这种经过人工修饰的半抗原称之为人工合成抗原，用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。 （一）人工合成抗原制备 1.常用的载体 ⑴蛋白质类 ⑵多肽聚合物 ⑶大分子聚合物 2.半抗原与载体的连接 半抗原 + 载体（蛋白、合成载体 ）= 完全抗原 物理法或化学法连接 3.人工结合免疫原的鉴定 要鉴定人工结合免疫原的质量，必须要测定偶联在载体上的半抗原量，常用的测定方法有吸收光谱分析法和核素标记半抗原渗入法。 用化学方法将活