溶菌酶检验标准.docx

. 术语和定义 溶菌酶酶活性单位：在 25℃、 pH 值为 6.2 的条件下，于 450nm 处每分钟引起溶酶小球菌体 （Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降 0.001 所需要的酶量为一个酶活性单位 U。本定义适合“比浊法” 。 溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为 u。本定义适合“管碟法” 。 技术要求 外观和性状要求 粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。 技术指标 粉酶水分含量：≤ 12%。 粉酶粒度： 420μm 孔径分析筛筛上物≤ 4%。 粉酶炽灼残渣：≤ 10.0%。 酶活（效价）指标 表 1 产品成分分析保证值 项目 指标 粉状 50型 溶菌酶酶活性（效价） ，≥ U/g （ u） 500000 卫生指标 符合 GB 13078 和 NY/T 722 的有关规定。 试验方法 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的三 级水，所用试液中的标准溶液， 在没有注明其他要求时均要求按 GB/T 601 ，GB/T 602 制备。 外观的测定 取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。 粉酶水分的测定 按 GB/T 6435 规定进行检测。 粉酶粒度的测定 按 GB/T 5917 规定进行检测。 粉酶炽灼残渣的测定 . . 按《中国兽药典》规定进行检测。 卫生指标的测定 按饲料卫生标准 GB13078 和 NY/T 722 规定的方法进行。 溶菌酶酶活性（效价）的测定 溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下， 通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用， 计算出溶菌酶 活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法） 。 试剂和溶液 溶酶小球菌（ Micrococcus Lysodeiktidus） 将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置 37℃培养 48 小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡 黄色粉末，供测定用，保存一年。 使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过 5 代，斜面菌种从培养好到 使用时间，最长不超过 2 个月。并将培养好的斜面菌种，放置 4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置 4℃冰箱保存。 磷酸缓冲液 称取磷酸二氢钠 （ NaH2PO4.2H2O ）11.7g, 磷酸氢二钠 （ Na2HPO4.12H2O ）7.86g，加 900mL 水溶解 ,调 pH 值至 6.2，定容至 1000mL。 10％氢氧化钠溶液 1％硫酸铜溶液 30%三氯醋酸 斜面培养基：营养琼脂 抗生素检定培养基 II 号 溶菌酶标准品 仪器 分析天平：精密度 0.1mg； 牛津杯：牛津杯内径 6.0±0.1mm，外径 7.8± 0.1mm，高 10.0± 0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过± 0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致； 陶瓦盖：内径约 103mm，外径 108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌；游标卡尺：精度 0.02mm； 双碟：内径约 90mm，外径 16mm～ 17mm 的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡； 超净工作台：有效工作面局部洁净度 100 级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备； pH 酸度计：精确到 0.01； 分光光度计：配 10mm 比色皿，可在 450nm 下测定吸光值； 离心机：转速为 4000r/min 以上； 秒表：每小时误差不超过 5s； 恒温培养箱：设置漂移温度为 35℃～ 37℃； 高压灭菌锅 烘箱 其它玻璃器皿：刻度吸管 : 1 mL， 2mL， 5mL， 10mL， 25mL 无菌吸管等； 试验方法 5.6.3.1鉴别 固体样品：取本品 10mg，溶于 1mL 水中，加 30%三氯醋酸 2 滴，产生白色沉淀。 取试管一支，加 5%溶菌酶水溶液 2 滴、 10%氢氧化钠 5 滴及 1%硫酸铜溶液 1 滴，混匀后， . . 应显紫玫瑰色。 5.6.3.2方法一：比浊法 特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在 450nm 条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活力。 试验步骤： 精确称取样品 （液体样品需在离心机上以 3500r/min 离心 10min 后取上清液） 不少于 20mg，用 pH6.2 的 0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释到酶活单位为 100U/ mL ~200U/mL ，备用。 将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活