基于ARTP和适应性进化选育高抗逆性凝结芽孢杆菌及其发酵豆粕的研究.docVIP

摘 要 凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益生菌，相比于其他菌群，其芽孢体对热、酸、碱、盐等不敏感，可经受高温加工、胃肠道酸碱环境，有效降低染杂菌风险，目前已成为饲料领域微生态制剂的优势菌群之一。然而，并非所有天然存在的凝结芽孢杆菌都对酸、碱、盐等压力环境具有优良的抵抗性能。因此，在前期已成功从健康猪肠道内容物分离纯化并鉴定出一株凝结芽孢杆菌，命名为WT-03的基础上，本研究利用常压室温等离子体诱变(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP) 结合适应性进化 (Adaptive laboratory evolution, ALE ) 策略对其进行抗逆性能改善，筛选具备耐酸、耐胆盐等高抗逆性的目的菌株，并从胞内微环境、细胞结构以及细胞膜层面对其抗逆性机制进行初步探究；最后，将其用于固态发酵豆粕，优化发酵条件，对发酵前后的营养品质进行评价。 主要研究内容有： 采用ARTP结合适应性进化选育了耐酸、耐胆盐的高抗逆性凝结芽孢杆菌。ARTP最优照射时间为15s，致死率93.84%。利用含0.3%(w/v)胆盐的MRS筛选培养基对诱变15s的菌体进行初筛，得到30株生长态势良好、菌落较大的突变株artp-BC1、artp-BC2……artp-BC30。之后，利用盛有pH4.0、pH3.5和pH3.0的24孔板液体培养基对初筛菌进行复筛，最终得到artp-BC5、artp-BC15、artp-BC28三株突变株，在pH3.0存活率显著高于野生株，分别为18.2%、18.8%和19.3%。40d的梯度酸驯化实验显示，artp-aleBC15在pH2.5存活率最大，为19.8%；而对照菌WT-03仅为7.15%。体外模拟胃肠道实验表明，artp-aleBC15、artp-BC15和WT-03最终存活率分别为20.5%、15.2%和7.98%。因此，artp-aleBC15为理想菌株，已存于中国工业微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.17145。 从胞内微环境变化、细胞结构和细胞膜水平对凝结芽孢杆菌突变株和野生株的耐酸性机理进行了探究。外界酸胁迫导致胞内pH（pHi）降低，pH6.2时，artp-aleBC15、artp-BC15和对照组WT-03的pHi均在7.10左右；而pH2.5时，突变株artp-aleBC15、artp-BC15和对照株WT-03的pHi分别为4.90、4.45和4.23。扫描电镜结果表明，artp-aleBC15在pH2.5环境能更好的保持结构完整性。细胞膜水平的分析显示，artp-aleBC15能够形成更高强度的生物膜，且疏水性增强，通透性较低；同时，酸胁迫导致细胞膜饱和脂肪酸 (Saturated fatty acid, FA)增多、不饱和脂肪酸 (Unsaturated fatty acid, UFA) 减少、不饱和度增大。荧光定量PCR（qRT-PCR）分析发现，突变株artp-aleBC15中编码脂肪酸合成的基因plsX、acpP及fabD表达量显著上调，分别是野生株的6.998倍、15.995倍和9.474倍。 以酸溶性蛋白含量为测定指标，优化了B. coagulans artp-aleBC15固态发酵豆粕的条件，分析了豆粕发酵前后的营养品质变化。单因素及正交设计结果表明，最优条件为：接种量12%，料水比1.0:1.2，发酵温度37℃，发酵时间72h。发酵后，豆粕中酸溶性蛋白含量由3.285±0.690%提高到20.438±0.550%、粗蛋白含量由46.774±0.242%提高到49.125±0.486%，总酸度由2.281±0.150提高到8.457±0.260，氨基酸总量由53.0%提高到55.8%。SDS电泳图谱显示，发酵后豆粕蛋白被充分降解，分子量20KDa。 关键词：凝结芽孢杆菌，常压室温等离子体诱变，适应性进化，抗逆性机理，发酵豆粕，工艺优化 Abstract Bacillus coagulans is a probiotic with the advantages of both Lactic acid bacteria and Bacillus. Compared with other bacteria, its spores are not sensitive to heat, acids, alkalis, salts, etc., and can withstand high temperature processing, gastrointestinal acid and alkali environment,which can significantly reduce the