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质粒DNA的提取、定量、与PCR鉴定 ;一、实验流程;二、实验目的;聚合酶链式反应(PCR)
Polymerase Chain Reaction;仪器: PCR仪(BioRad MJ mini)
台式离心机
灭菌的薄壁离心管
微量加样枪
凝胶电泳系统等
凝胶成像系统;;1、 菌液:DNA模板
大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T);2、引物: 正向引物: 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’
反向引物: 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC3’
3、2×Premix :
Taq酶:5U/μl
4×dNTP: 10mM each
10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3)
MgCl2: 25mM
4、灭菌去离子水;① 94℃预变性2 分钟后开始以下循环
② 94℃ 30 秒
55℃ 30 秒 30 循环
72℃ 60 秒
③ 72℃ 8 分钟;
④ 4 ℃ 保温。
实验过程约1小时30分钟;;灭菌去离子水;四、结果分析;* 由1985年穆里斯(K. Mullis)发明,他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外复制DNA的过程。;;;PCR 反应系统的组成;(一)模板DNA
PCR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体外扩增。
模板的浓度要适当
基因组DNA:50-100 ng
质粒DNA: 5-10 ng;(二)引物
与摸板DNA链互补的小片段DNA分子;作为DNA复制的起始点, 即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。
PCR特异性反应的关键;;引物的特异性:引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用
引物的浓度:引物量太低,则产物量降低,会出现假阴性
引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成
一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 ~ 1μmol/L 为宜
引物的设计:使用引物设计软件Oligo 6, Primer premier, NTI 9.0, Omiga, Dnastar等;引物的设计原则:;(三)Taq 酶
从水生栖热菌 Thermus Aquaticus ( Taq )中分离出的热稳定性 DNA 聚合酶
酶浓度:酶的浓度太低会使扩增产物产量降低,如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增
每 100μl 反应液中含 1-2.5U Taq DNA 聚合酶为佳
保存:-20 ℃;Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus);(四)dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;(五) Mg2+;①变性温度与时间;PCR循环次数
循环次数要恰当:一般是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加。当然循环反应的次数太少,则产率偏低。所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数。
常规PCR循环次数一般为25~40个周期。;PCR相关技术;荧光定量PCR(real-time PCR);PCR相关技术;PCR技术的主要用途;PCR的临床应用;质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA;一、什么是质粒?;质粒提取方法;基本步骤;二、实验原理;三、实验材料;米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5,其编码基因位于1号染色体的特异部分(1p36)。当CHD5失去功能的时候,细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关,这提示CHD5与多种人类癌症有关。根据CHD5的调节功能,可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前,这个基因一直是个谜。这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响,提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现,许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失,说明CHD5与人类癌症有莫大关系,打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。 ;溶液P1(细菌悬浮液)
已加入RNaseA
溶液P2(细菌裂解液)
溶液P3(中和液)
去蛋白液PE
洗脱液WB
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