蛋白质的分离、纯化和表征.pptxVIP

Protein; 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。; 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 ??/酸越大——pI 越大;二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质;（二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 ; 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等;1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性;等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？;盐析;2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀;4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态;一.?分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能： 要求纯度高，不变性； 2.提取活性的酶或蛋白质： 必须保持天然活性状态； 3.作为药物或食品添加剂： 纯度要求一般。 二、蛋白质提纯的总目标： 增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。;三、蛋白质分离纯化的一般原则;2、根据溶解度分;五、蛋白质的分离纯化方法;;凝胶过滤;凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大. 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex;（二）利用溶解度差别的纯化方法;2.?盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。;3.有机溶剂分级分离法; 电泳原理 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同;电泳迁移率(泳动度);水平式平板凝胶电泳;等电聚焦电泳;双向电泳;离子交换层析;（七）利用蛋白质选择性吸附的性质;利用选择性吸附的纯化方法 ;（八）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法;六、蛋白质含量测定和纯度鉴定; 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 ;（一）根据化学组成测定最小分子量;（二）凝胶过滤法测定相对分子质量;;（三）SDS－PAGE测定相对分子质量;;沉降速度法测定相对分子量;蛋白质的含量测定与纯度测定;蛋白质含量测定Ⅱ;蛋白质含量测定Ⅲ;蛋白质纯度鉴定; 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。;1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性;一.?分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能： 要求纯度高，不变性； 2.提取活