药代动力学实验.ppt

样品的预处理 样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤 样品预处理常用的方法 高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA 样品分析时第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 神农尝百草 传说神农一生下来就是个“水晶肚”，几乎是全透明的，五脏六腑全都能看得见，还能看得见吃进去的东西。那时候，人们经常因乱吃东西而生病，甚至丧命。神农为此决心尝遍百草，能吃的放在身体左边的袋子里，介绍给别人吃；不好吃的就放在身体右边袋子里，作药用。不能吃的就提醒人们注意。 生物样品 药物代谢动力学 定量研究药物（包括外来化学物质）在生物体内吸收、分布、排泄和代谢（简称体内过程）规律的一门学科。 常用测 定方法 HPLC-UV ? GC-MS ? LC-MS/MS ? 数据处理分析 1.HPLC原理与标准操作规程(SOP) 2.实验设计与动物实验 3.样品处理与方法开发 4.定性定量与分析测定 5.数据处理与药动学参数计算 6.实验报告 实验安排 静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究 HPLC原理与标准操作规程(SOP) 1.HPLC的组成 2.分配色谱的原理 3.色谱柱 4.流动相 5.定性与定量方法 6.样品的预处理 7.反相色谱分析方法的开发  High Performance Liquid Chromatography HPLC 的组成 Pump 泵 Injector/Autosampler 进样器/自动进样器 Column 色谱柱 Detector 检测器 Data System/Integrator 数据系统/积分仪表 高效液相色谱系统 高效液相色谱系统 SHIMADZU LCMS-2010EV LC-MS/MS Thermo TSQ Quantum Access 分配色谱的分离机理 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相 对HPLC柱的了解 色谱柱分类 填料，含碳量，基质，粒径 色谱柱的应用 正相柱，反相柱，预处理柱 色谱柱的规格 岛津 Shimadzu VP-ODS; 150L×2.0; 5μm; 柱号 8082693. 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 反相C18色谱柱的活化 步骤一： 90%甲醇1mL/min流速冲洗30min 步骤二： 10%甲醇1mL/min流速冲洗30min 步骤三： 90%甲醇1mL/min流速冲洗60min 色谱柱的存放 存放前的处理 除去杂质、盐  合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶ 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止