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第八章节动物遗传操作 动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。（2）易分离提纯，成本低廉。现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。（3）产量高。外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。  二、基因打靶（gene targeting） 1.定义 应用同源重组原理将外源DNA定点整合到宿主细胞基因组，替代靶序列整合在预定的基因位点，从而改变细胞甚至生物个体遗传特性的遗传操作方法。 2.意义 利用基因打靶，可以将某个基因敲除（gene knockout），使之失去功能，继而通过表型分析研究该基因编码的特异蛋白的功能，诠释基因功能，是功能基因组学研究的有力工具。 可以通过将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。还可以将某些药物用蛋白基因定点敲入高等生物基因组中的高表达基因座，获得高效的生物反应器。 基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。 三、细胞的转染与筛选 细胞转染（cell transfection）是指外源基因导入真核细胞的过程 。 根据不同的实验目的，外源DNA导入哺乳动物细胞有两种类型：瞬时转染和稳定转染。 瞬时转染：外源基因进入受体细胞后，并未整合到细胞的染色体，而是应用宿主细胞的表达系统瞬时表达外源基因，一般在基因导入细胞1~4d后收获细胞进行目的基因表达分析，外源基因DNA在宿主细胞内会逐步降解。 稳定转染：需要外源基因整合到宿主细胞的染色体上，从而得到稳定的转染细胞株，达到长期表达外源基因的目的。 Human gene therapy 人的基因治疗 （一）细胞的转染方法 1、磷酸钙法 2、阳离子脂质体法 转染效率高，细胞毒性低，操作简单，能把DNA和RNA转染到各种类型的细胞，没有免疫原性，是目前常用的动物细胞转染方法。脂质体法转染效率受脂质体成分、细胞种类及实验条件等诸多因素的影响。 3、逆转录病毒介导法 目前应用最广泛也是效率最高的外源基因转运系统，但由于其可能存在的遗传毒性、免疫原性及难于像质粒那样大规模制备重组病毒而限制了应用。 4、电穿孔法（electroporation） 理论上讲电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。因为细胞的死亡率高，此法每次转染需要更多的细胞和DNA。 每种转染方法都有其局限性和适用范围，不存在适合于所有细胞的转染方法。 （二）阳性细胞的筛选方法 1.阳性细胞的筛选策略 目前常用的筛选策略有正负筛选法（postive-negative selection，PNS）和正向选择法（无启动子筛选法，无PolyA筛选法）两类。 2.阳性单克隆的筛选方法 （三）阳性细胞的分子遗传鉴定 筛选得到抗性细胞克隆，表现出对G418的抗性和对GANC的耐受性，但此时目的基因是否发生了定点整合，仍需做进一步的分子水平鉴定。中靶细胞的鉴定常采用PCR和Southern杂交分析的方法。PCR方法以快速、操作简便的特点而广泛适用于对大量样品的快速鉴定，是一种比较理想的粗筛方法。其引物设计的特点是一条位于打靶载体的正选择标记基因内，另一条位于同源短臂序列以外的旁侧片段上。用PCR法筛选鉴定时，有时会出现假阳性结果，原因可能是参入了其他细胞克隆或PCR鉴定载体，所以应采用Southern杂交作进一步的分析。 第三节 动物克隆 什么是动物克隆？ 指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传背景后代的过程，包括孤雌激活生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割以及核移植等。 通常，将所有非受精方式繁殖所获得的动物均称为克隆动物，将产生克隆动物的方法称之为克隆技术。 动物克隆的意义有哪些？ 1.能使遗传性状优秀的个体大量增殖，大大加快动物育种进展； 2.可用来扩大转基因动物的