- 1、本文档共39页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
;基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合(天然存在)
基因文库(gene library):从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同,基因文库分为:;3;4;;; 超声波处理后的DNA片段呈平头末端,需加装人工接头
部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,如:Sau3AI或MboI等,这样DNA酶解片段的大小可控。;3、载体和受体的选择与制备
出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒;对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。
由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb,因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。;9;10;第二节 cDNA基因文库的构建;二、cDNA文库的构建:
1、RNA的分离
mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA,而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪,平均为2%,mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小,因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量,可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。
1)根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件,用于提取RNA。
2)保持mRNA的完整性,是构建全长cDNA文库的核心。
3)选取合适的提取方法,除完整性外,mRNA还要求纯度高、DNA污染少,最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。
4)RNA定量准确,保存合理。
5)根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。;2、第一链cDNA的合成
由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT),由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶,合成DNA是需要引物引导。常用的引物有:
oligo(dT)引物:在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物, oligo(dT)引物与mRNA 3’末端的poly(A)配对,引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA,反转录的是整个表达谱,可以产生全长cDNA,应用最广。
随机引物:与mRNA分子内的多处配对,从多个位置合成cDNA第一链,反转录的几乎是整个表达谱,最多只能产生近全长cDNA,适合于得到总cDNA的5’末端。
基因特异引物(gene-specific primer, GSP):仅反转录特定目标基因cDNA的5’末端。
有AMV和MMLV两种RTase,最适温度分别为42℃和37℃,需要敲除其RNase H活性,较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构,得到全长cDNA。
反转录过程中要防止mRNA降解,可以添加RNase抑制剂。;3、第二链cDNA的合成
cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。 4种cDNA第二链合成的方法:
自身引导合成法:解离的cDNA第一链的3’末端会产生一个发夹状结构,可以引导第二链的合成,然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5’不完整,且S1核酸酶处理不好控制,易导致cDNA的丢失,所以该法现已少用。
置换合成法:RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶联合处理,得到近全长cDNA,5’缺失短序列。
引导合成法:利用末端转移酶在cDNA第一链的3’末端加上poly(dC)尾巴,利用poly(dG)为引物引导第二链合成,利用同源多聚尾与载体进行重组。
引物-衔接头合成法:引导合成法的改进型,在反转录引物和poly(dG)引物的5’引入优化设计的人工接头,可用PCR扩增广大总cDNA,也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。;15;16;17;18;19;20;21;22;23;24;25;26;27;28;29;30;31;32;33;34;35;36;37;38;39
您可能关注的文档
- disc性格测试及全面分析.pptx
- dis研究通电螺线管实验.pptx
- disc性格测试及全面分析完整版.pptx
- did方法与合成控制法.pptx
- disfagiayhernia吞咽困难及疝.pptx
- dka个案病历分析.pptx
- dka护理胰岛素的应用及补液原则.pptx
- dka的治疗及护理.pptx
- diyilun核酸和蛋白质上课用.pptx
- dka腹痛与急腹症鉴别.pptx
- 四川省德阳市罗江中学2025届高三考前热身化学试卷含解析.doc
- 山东省枣庄现代实验学校2025届高三下学期第五次调研考试化学试题含解析.doc
- 吉林省长春市十一高中等九校教育联盟2025届高三一诊考试生物试卷含解析.doc
- 2025届江苏省盐城市伍佑中学高考仿真模拟化学试卷含解析.doc
- 2025届广西贺州中学高考冲刺押题(最后一卷)生物试卷含解析.doc
- 安徽省池州市贵池区2025届高三第一次模拟考试生物试卷含解析.doc
- 宁夏银川一中2025届高三(最后冲刺)化学试卷含解析.doc
- 广东省广州市增城区四校联考2025届高考压轴卷化学试卷含解析.doc
- 2025届邯郸市第一中学高考生物必刷试卷含解析.doc
- 2025届安徽省安庆市石化第一中学高考仿真卷化学试卷含解析.doc
最近下载
- 最新2023版知识产权贯标GBT29490表单 知识产权目标策划管理方案[知识产权合规管理体系文件].docx
- (2024版)AOPA无人机驾驶证认证考试题库-上部分(500题)(含答案).pdf VIP
- 《中国共产党简史》第四章 夺取新民主主义革命的全国性胜利.pptx VIP
- 医院创建优质服务基层行创建资料(3.4.3护理安全管理).docx VIP
- 初三家长会班主任的发言稿.doc VIP
- 《中国共产党简史》第三章 全民族抗日战争中的中流砥柱.pptx VIP
- 商混站危险源辨识、风险分级管控资料.pdf
- 初中物理教师简短的自我鉴定.docx VIP
- 卧式多级给水泵检修的间隙测量与调整76997.doc VIP
- 初中的教师职称述职报告.docx VIP
文档评论(0)